利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

该方法有助于解答关于神经前体细胞及其后代在脊椎动物大脑发育过程中动态行为的基本问题。该技术的主要优势在于能够直接观察活体大脑中多个克隆相关细胞群在数小时发育过程中的动态变化。该方案还可应用于研究斑马鱼胚胎其他发育系统中的克隆及前体细胞动态。

使用该方法进行可视化对于直接观察神经发育过程中发生的基本过程特别有用。在进行显微注射的前一天下午，将野生型成年斑马鱼按性别分开放置在交配缸中。次日早晨，按照文稿说明配制DNA溶液，并在受精后45分钟内向单细胞期斑马鱼胚胎注射约4.2纳升该溶液。

将注射后的胚胎置于 E3 培养基中，并在 28 摄氏度的培养箱中培养 24 小时，随后统计并剔除该组中的死亡和畸形胚胎。将最多 20 个健康胚胎转移至一个 50 毫升离心管中，加入 10 毫升 E3 培养基，并在每根试管上盖上盖子。将装有 50 毫升离心管的试管架垂直放入 37 摄氏度的水浴中，持续 80 至 90 分钟，确保水浴的液面高于管内 E3 培养基的液面。

从水浴中取出试管架，放入28摄氏度的培养箱中。让E3溶液冷却至28摄氏度，并使胚胎适应此温度，过程可能需要长达一小时。随后，将胚胎转移至含有0.2毫摩尔PTU和预热至28摄氏度培养箱中保温的E3溶液的培养皿中。

在热激后2至4小时，使用标准荧光体视显微镜观察胚胎中CFP或YFP的表达情况，以判断Brainbow重组是否成功。挑选在整个胚胎中荧光蛋白表达强烈的个体，转移至另一含有PTU的培养皿中。在受精后1天、2天或3天对其进行成像观察。

在荧光显微镜下显得微弱的表达信号，在共聚焦延时成像中实际上可能清晰可见。在实验前一天，准备好成像培养皿和胚胎操作工具。准备成像培养皿时，将一个塑料环小心地用超级胶水粘附在直径60毫米的培养皿中央。

通过将一小段尼龙钓鱼线用强力胶粘在一根四英寸长的木制棉签末端来组装操作器。如有必要，在固定胚胎前，先在解剖显微镜下对胚胎进行去膜处理。固定胚胎时，将鱼样转移至成像室塑料环的中心位置，并用细尖移液器尽可能去除多余的 E3 溶液。

使用洁净的移液管将1%低熔点琼脂糖和E3培养基覆盖在斑马鱼上，用琼脂糖完全填充塑料环形成一层。然后轻轻将胚胎吸入移液管尖端，再缓慢放回琼脂糖中，注意避免引入任何气泡。在琼脂糖凝固前，使用胚胎操作仪迅速调整斑马鱼和琼脂糖的方向。

若使用直立显微镜成像，应将胚胎尽可能靠近琼脂糖的上表面放置，确保胚胎与成像室底部平行且尾部伸直。等待琼脂糖凝固后，用E3培养基填充成像室，尽量多加液体以补偿成像过程中可能发生的蒸发。随后将含有斑马鱼和E3培养基的成像室置于共聚焦显微镜上。

然后选择具有高数值孔径和长工作距离的物镜。找到细胞标记密度和亮度合适的区域，并设置采集参数。此例使用 Zen 软件，但具体设置将根据所用显微镜及可用的激光谱线而有所不同。

准备三条轨道，以依次成像每个荧光蛋白通道。使用氩离子激光器在458纳米波长激发CFP，在514纳米波长激发YFP，并使用561纳米DPSS激光器激发dTomato。在相应的波长处采集三种荧光的发射信号。

选择用于成像的Z轴扫描范围，以及10至30分钟之间的时间间隔，以追踪有丝分裂和凋亡事件。最后，设定成像会话的持续时间并运行实验。成像完成后，若使用Zen软件，请将原始数据保存为CZI格式，或保存为与Fiji兼容的其他格式，然后利用Fiji中的Bio-Formats导入器将图像导入。

通过活体多色延时成像技术，展示了发育中斑马鱼后脑增殖性脑室区细胞的 Brainbow 彩色编码克隆。沿特定放射状纤维排列的 Brainbow 标记细胞具有相同的颜色，该特征可通过相对 RGB 通道权重进行量化。

这表明这些放射状细胞群是分裂细胞的克隆，其相似的颜色可用于识别它们是否具有克隆关系。定量的颜色分析显示，子代细胞与其母细胞表达相同的颜色，但相邻的放射状细胞簇彼此之间可以区分开来。

可在体内同时追踪数小时内的多个相关细胞克隆，从而实现多重谱系分析与比较。对受精后两天及三天时克隆中颜色表达的定量分析显示，Brainbow 的表达从两天到三天基本保持稳定。延时成像揭示了在受精后一天至两天期间，大量细胞发生细胞核的同步性迁移和细胞分裂，使得细胞周期的研究成为可能。

计算得出平均细胞周期为8.4小时，与之前在斑马鱼中测得的结果相当。此外，该成像技术可用于观察单个细胞经历凋亡相关的典型形态学变化，例如细胞膜起泡和细胞碎裂。由于该方法在活体中进行，斑马鱼可在成像后从成像室中取出，并在后续时间点继续用于成像或其他实验。

该技术的应用使我们能够探索关于克隆相关细胞在神经发育过程中作用的新问题。