基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型通过重组腺相关病毒载体立体定向注射的建立方法

本实验的总体目标是通过立体定向注射中枢神经系统，建立基于病毒载体的帕金森病动物模型。该方法可用于构建正常的动物模型，从而进行临床前药物测试，并有助于研究帕金森病以及多种其他神经退行性疾病的分子机制。该技术的主要优势在于能够对脑区进行特异性靶向。

可实现高效的脑部转染表达，并可用于在特定动物品系和物种中建立动物模型。目前已开发出多种不同的终末载体系统。载体系统的选择取决于您希望表达的转染片段大小、基因表达的持续时间、靶向的脑区以及生物安全问题。

本实验操作将由本实验室的技术员 Annelies Aertgeerts 示范。首先，根据批准的实验方案，对一只八周龄的雌性Wistar大鼠进行适当的麻醉。通过轻捏每只足掌来检查是否已达到外科麻醉水平，并确认无退缩反射。

接下来，使用 MicroTransponder 植入器将 MicroTransponder 植入大鼠背部。检查 MicroTransponder 是否定位正确，并确认能够获得读数。然后剪除大鼠头皮上的毛发，并在头皮和耳朵部位施用局部麻醉剂。

将大鼠转移至超净工作台，后续操作均采用无菌技术进行。通过固定耳杆，随后固定口腔和鼻部杆，将大鼠置于立体定位仪中。用纸制毯子覆盖大鼠身体，以防止体温下降。

涂抹眼用润滑剂以防止眼睛干燥。随后根据批准的程序对头皮进行消毒。此处使用含1%碘的70%异丙醇。

在颅顶正中线做一小切口后，轻轻刮除颅骨上的膜状物，并用生理盐水冲洗。待颅骨干燥后，确保前囟和后囟清晰可见。随后，用重组AAV填充一支10微升、30号、20毫米的微量注射器，并将其安装到与立体定位仪相连的电动微量注射泵上。

对于黑质多巴胺能神经元的特异性转导，重组腺相关病毒（AAV）载体是首选，因其具有高滴度以及高效转导多巴胺能神经元的能力。通过释放一滴AAV来测试液体流动情况。将任何已释放的AAV弃置于多价清洁去污剂中处理。

目视检查头部是否在头架中固定端正。然后通过以下步骤检查颅骨是否水平：首先将针尖移动至前囟，通过在背腹方向降低针尖直至接触颅骨，测量此处的高度。在后囟处重复此操作。

将针头回退至前囟后，沿前后方向和内外侧方向移动针头至用于微量注射的立体定位坐标。记录下该坐标值。在注射位点处，如前所述测量颅骨高度，并确保其与前囟高度的差异不超过0.3 mm。

然后在颅骨上小心钻一个两毫米的孔。钻孔完成后，测量硬脑膜的高度，以确定背侧-腹侧坐标的参考位置。使用26号针头穿透硬脑膜。

用无菌纱布吸去血液，待所有出血停止后方可继续操作。现在将预装好试剂的显微注射器针头缓慢插入脑内，到达背腹向坐标位置，暂停一分钟。

然后以每分钟0.25微升的速度注射3微升AAV。注射完成后，将针头留置原位5分钟，以防止液体沿针道回流，随后缓慢拔出针头。使用编号的编织聚酯线3.0缝合头皮，并用1%碘溶液和70%异丙醇对皮肤进行消毒。

松开鼻部和口腔杆，然后松开两个耳杆，轻柔地将动物从立体定位仪中取出。此时给予镇痛剂，如有需要，可给予麻醉逆转剂。随后将大鼠置于洁净的笼子中，笼子放置在设定为 38 摄氏度的加热板上，并密切监测直至其苏醒。

手术后，可通过行为学测试和PET成像在整体动物水平研究神经退行性变的动力学过程，牺牲动物后则可采用免疫组织化学技术进行研究。为评估前肢的自发使用情况，我们在向黑质注射表达A53T突变型α-突触核蛋白的重组AAV后不同时间点进行了圆筒实验。自注射后三周起，接受中等剂量的实验大鼠即表现出显著的运动功能障碍。

注射后四周，对侧前爪自发使用率下降了50%。而对照组注射eGFP的动物未显示前爪使用上的不对称性。接受较高剂量重组AAV 2/7A53T α-突触核蛋白的大鼠在注射后29天表现出更明显的前爪使用功能障碍。

为了证实所观察到的运动障碍与多巴胺相关，给予动物单次剂量的L-多巴。在L-多巴处理后45分钟重复进行圆筒实验，结果显示，接受重组AAV 2/7A53T α-突触核蛋白注射的动物前肢使用功能完全恢复。为了在个体动物中无创地长期追踪黑质纹状体多巴胺能神经变性的动力学过程，采用以F-18FECT为放射性配体的小动物正电子发射断层扫描，定量检测多巴胺转运体的结合情况。

在注射重组 AAV 2/7A53T α-突触核蛋白的大鼠中，随着时间推移，同侧尾状核的 DAT 结合显著减少。32 天后，观察到 DAT 结合减少高达 85%。作为阳性对照，在黑质注射神经毒素 6-OHDA 可在 7 天内诱导 DAT 结合丧失达 90%。

随时间推移，对经微量注射重组 AAV 2/7A53T α-突触核蛋白的大鼠脑切片进行酪氨酸羟化酶免疫染色，后者是多巴胺能神经元的标志物。该图显示了微量注射后 29 天内多巴胺能神经元进行性丢失的情况。一旦掌握，该技术可在 45 分钟内完成。

在进行该操作时，使用高质量的最终载体匹配至关重要。完成该操作后，可进一步开展其他技术，如无创性正电子发射断层扫描（PET）成像、行为学分析以及免疫组织化学分析，以评估神经退行性变和神经病理学的程度。观看本视频后，您应能够充分掌握如何向黑质注射病毒载体，从而建立基于病毒载体的帕金森病动物模型。

请注意，操作病毒载体可能存在危险，因此在进行本实验时，务必采取相应预防措施，例如在层流罩内操作以及对废弃物进行适当的去污染处理。