高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

本克隆与转化实验的总体目标是高效构建CRISPR载体，并获得可用于功能基因组学研究的基因敲除突变番茄根系。该方法在植物基因组学领域中具有重要应用价值，因其可大规模生成基因敲除突变体，用于研究多种根系生物学过程。该技术的主要优势在于克隆过程可在单一步骤中完成，使得研究团队仅需数周时间即可获得所需材料。

首先，设计包含目标序列中GN19区域的向导RNA（gRNA）寡核苷酸，其两侧需加上用于DNA组装的5'端和3'端各20个核苷酸序列。取1至5微克P201N caznine质粒，用限制性内切酶Spe1在37摄氏度下消化2小时。根据生产商说明书对消化产物进行柱纯化后，重悬于15微升10毫摩尔Tris HCl溶液中。

通过紫外分光光度法测定DNA的含量。使用限制性内切酶Swa1在25摄氏度条件下进行第二次消化，持续两小时。取100至200纳克样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，以确认消化完全。

正确消化的质粒将在14,313个碱基对处显示一条单一条带。为通过PCR扩增截形苜蓿（medicago truncatula）的启动子和支架DNA，请使用来自puck gRNA穿梭质粒的六个启动子及支架DNA。采用Swa1引物以及Mtu6F与MTU6R引物，结合Spe1位点的scaffold F与scaffold R引物，在高保真聚合酶体系中进行扩增。

通过1%琼脂糖凝胶电泳观察3 µL PCR产物，以确认扩增效果。MTU6扩增片段为377个碱基对，支架扩增片段为106个碱基对。根据制造商说明书，对剩余的PCR产物进行柱纯化。

使用紫外分光光度法进行定量，并于负20摄氏度保存。接下来，用实验室级水将整管gRNA寡核苷酸重新悬浮至100微摩尔浓度。取1微升寡核苷酸加入500微升1×NEB缓冲液2.1中，充分混匀。

使用带有加热盖的热循环仪，设置程序在 50 摄氏度保温。将 100 纳克线性化载体、50 纳克 MtU6 启动子、12 纳克支架序列和 1 微升稀释后的 gRNA 引物溶于水中，总体积为 5 微升。加入 5 微升 2X 高保真 DNA 组装预混液。

充分混匀后离心。将反应体系置于50 °C恒温循环仪中孵育60分钟。50 °C孵育1小时后，将反应管置于冰上冷却，取2 μL用于按照标准方法转化感受态大肠杆菌细胞。

将转化产物涂布于添加了50毫克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上，37摄氏度过夜培养。使用引物StUb3p 218R和1Sce1R通过PCR筛选菌落。取剩余DNA组装反应液适量，用水按1:5稀释，取1微升作为菌落筛选的阳性对照。

同时加入一纳克的环状P201N casnine质粒作为无插入片段的对照。根据方案书面部分所述的参数进行PCR扩增后，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳观察。正确插入的产物显示为725个碱基对的条带，而无插入片段的载体则显示为310个碱基对的条带。

将阳性克隆在LB Can50液体培养基中于37摄氏度过夜培养。次日，按照生产商说明书，使用质粒提取试剂盒纯化质粒。使用StuB3P218R引物对纯化后的质粒进行Sanger测序，随后将测序色谱图与MtU6启动子、靶序列及支架序列进行比对，以确认克隆过程中未引入错误。

通过用EcoR5和Sti1酶切一微克质粒进行诊断性酶切。在0.8%琼脂糖凝胶上观察时，应出现此条带模式。最后，将质粒转化至农杆菌Rhizobium rhizogenes菌株ARqua1中，方法是将一微升质粒样品加入50微升电转化感受态细胞中，并在1毫米比色皿中进行电穿孔。

加入约 500 µL SOC 培养基，在 28 °C 下振荡培养 2 小时。然后接种至 LB Can50 平板，在 28 °C 下培养两天。本步骤开始时，将番茄种子置于 20% 家用次氯酸钠溶液中灭菌 15 分钟，并持续混匀。

然后将种子转移至超净工作台。去除次氯酸钠溶液，并用无菌实验室级水清洗三次。将30粒种子接种于含有½ MS培养基的GA7培养盒中。

在黑暗条件下培养约两天，待种子萌发后，将GA7培养盒转移至光照环境中。转化前一天，在含有Can50的固体LB培养基上划线接种农杆菌（A.rhizogenes），并在28摄氏度下过夜培养。转化当天，在超净工作台中向50毫升的1/2 MS培养基中加入25微升乙酰丁香酮，并将6毫升培养基分装至每根培养管中。

使用弯曲的 200 微升枪头从平板上刮取发根农杆菌（A.rhizogenes）细胞，并重悬于 6 毫升的 1/2 MS 液体培养基中。涡旋振荡管子，使细胞完全重悬。每种载体的细胞重悬后，取 1 毫升菌液，在 600 纳米波长下测定光密度值。

向含有无菌滤纸的培养皿中加入两毫升1/2 MS液体培养基。从幼苗上切下子叶，并放置于湿润的滤纸上。待所有子叶收集完毕后，切除每个子叶最远端的一厘米，得到两端均被切割的子叶片段。

将外植体加入 A.rhizogenes 溶液中并混匀。偶尔倒置，于 A.rhizogenes 溶液中孵育 20 分钟。在 A.rhizogenes 孵育期间，为每个构建体转化准备一个培养皿，并在其中放入一片滤纸。

同时，在超净工作台中将不含抗生素的一半MS固体培养基放置至干燥。使用无菌镊子将子叶从根癌农杆菌（A.rhizogenes）溶液中取出，并置于干燥的滤纸上。在进行下一步转化时，用培养皿盖覆盖，以确保组织不会干燥。

接下来，将子叶在滤纸上吸干，然后转移到一半 MS 培养基上，背面朝上。用外科胶带包裹培养皿，在室温下避光共培养两天。共培养后，将子叶背面朝上转移至添加补充物的一半 MS 培养基中。

用医用胶带包裹。将培养物置于室温下，以荧光灯提供每日16小时光照周期的条件下培养。培养1.5至2周后，使用无菌镊子和手术刀从子叶处切取至少2厘米长的根段，并转移至添加了替卡西林/克拉维酸和卡那霉素的1/2 MS培养基中。

将10到15条根转移至一个培养皿中。用记号笔标记根尖的位置。用医用胶带封好，并在培养室中培养。

一周后，可在选择性培养基上观察到转化根的生长。使用首选的DNA提取方法，收集部分转化根样品进行DNA提取。转化11天后，可观察到毛状根从子叶处长出。

根在添加了替卡西林/克拉维酸和卡那霉素的一半MS培养基上筛选约一周。灰色条表示接种时根尖的位置。这是通过克隆和测序PCR产物来检测DNA突变的示例，该实验针对四个不同的毛状根事件中的两个不同基因靶标。

灰色框表示 GN20 GG 靶序列，delta 表示突变类型。右侧显示了具有指定突变的克隆数量。这是用于检测 DNA 突变的聚丙烯酰胺凝胶示例。

大片段缺失和杂合二聚体条带表明在靶序列处存在DNA突变。12个独立事件中有6个被判定为突变体，以delta符号表示。WT表示野生型对照，NT表示无模板对照。

一旦掌握该技术，可在一周内构建出数十至数百个CRISPR载体，且可在数周内获得大量分组材料。在进行该操作时，关键步骤是彻底清除并抑制任何残留农杆菌的生长。农杆菌过度生长会抑制根组织的发育并导致其死亡。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用DNA组装技术构建CRISPR载体，以及如何通过毛状根模型系统和番茄来验证这些载体的功能。