利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

本方案是一种在小鼠输卵管中进行基因组操作的高度灵活方法。它能够在免疫功能健全的环境中，形成周围被未编辑细胞包围的散在突变细胞。这一特性有利于研究癌症的起始过程。

该技术的主要优势在于其高度的适应性，能够通过简单互换突变组合，灵活地靶向特定的器官、区域、部位或细胞类型，且无需依赖特定的小鼠品系。该方法可轻松适用于具有管腔的器官以及实质器官。首先，使用微量移液器拉针仪将玻璃毛细管拉制成尖锐的尖端。

使用一对锥形超细尖镊子，在解剖显微镜下剪断拉制好的毛细管末端，形成开口。注意开口不宜过大，以免损伤输卵管并影响缓慢注射。接下来，将无菌手术器械、显微镜、显微操作仪和电穿孔仪放置在洁净无菌的工作台面或生物安全柜内。

将加热垫加热后置于一个干净且配备齐全的笼子下方。向培养皿中倒入无菌的1×PBS。使用一把干净的剪刀，将吸水纸剪成一乘一厘米的方块。

将这些毛细管针浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡。接着，将拉制好的毛细管针安装到由磁性底座固定的钳夹式显微操作器上。用移液器吸取2 µL注射溶液，滴加到无菌培养皿中。

在显微镜下观察的同时，使用连接在显微操作仪上的气压注射器，缓慢吸取一到两微升注射液进入显微注射针中。注意避免吸入气泡。将一只六至八周龄的雌性小鼠麻醉并皮下注射卡洛芬后，将其置于加热的吸水纸上，背部朝上放置。

在每只眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中眼睛干涩。使用镊子轻夹脚趾，确认麻醉成功后，去除切口部位周围的背部毛发，并用消毒剂擦拭裸露的皮肤。用一对直头钝镊夹住裸露的皮肤，沿身体正中线用无菌剪刀做一处长约1厘米的切口。

使用无菌 Adson 镊子夹住切口一侧并轻轻提起。然后，使用无菌有齿弯镊，从正中切口开始，向侧方轻轻分离皮肤与体壁。找到肾脏下方的脂肪垫后，使用无菌直头钝镊，在脂肪垫正上方夹住体壁。

使用无菌的尖头解剖剪在体壁上做一个小切口，注意避开血管。继续用直头钝头镊夹住体壁的同时，将无菌的钝头弯镊插入切口，扩大体壁上的切口。用钝头弯镊夹住可见的脂肪垫，并将其从切口中拉出，以暴露卵巢、输卵管和子宫。

使用无菌的 bulldog 夹夹住脂肪垫，保持生殖道暴露。将麻醉后生殖道已暴露的小鼠小心地放置在解剖显微镜的载物台上。调节显微操作仪，使装有溶液的注射针在显微镜下可见。

然后调整显微镜，以便于观察卵巢、输卵管和子宫。使用一对无菌的锥形超细尖镊子夹住待注射的输卵管部位，该部位必须与显微注射针的方向对齐。

调整显微操作仪，用显微注射针刺穿输卵管，同时使用锥形超细尖镊子将输卵管轻轻推至针尖上。轻柔移动显微注射针，确认其已插入输卵管内。在观察蓝色溶液流动及输卵管管腔扩张的情况下，缓慢向输卵管内注射1 µL注射液和5%过滤后的台盼蓝溶液。

避免将气泡注入管腔内。注射后，将针头从输卵管中取出，并用预先浸有PBS的吸水纸覆盖待处理区域。用一对电极镊子夹住预先浸湿的纸和待处理区域，然后将其从身体上拉开。

使用30伏特电压，对目标区域施加三个单极脉冲，每个脉冲持续50毫秒，脉冲间隔为1秒。电穿孔后，移除吸水纸，将小鼠放回加热垫上。松开蚊式止血钳，小心地将暴露的生殖道推回体壁下方。

在两侧输卵管完成电穿孔并放回体壁下方后，使用持针器夹住缝合针。用无菌弯齿镊夹起并提起切口一侧的组织，然后使用持针器操作缝线，缝合伤口。

将小鼠移至放置在加热垫上的清洁笼中，并持续观察直至小鼠恢复活动。使用3毫米或1毫米镊形电极进行电穿孔后，TdTomato标记的靶向区域仅局限于输卵管远端上皮。使用3毫米镊形电极时，靶向区域覆盖了更大部分的壶腹部，而使用1毫米镊形电极时，靶向区域仅限于最远端的伞部顶端。

在靶向区域中，由 TdTomato 标记的电穿孔细胞随机分布于未电穿孔的细胞之间。此外，电穿孔细胞仅局限于黏膜上皮层，在其下方的间质层或肌层中未观察到。为确认 CRISPR 介导的基因组编辑，可通过 FACS 分选分离出荧光细胞，进而提取 DNA 并进行测序。

这使我们能够量化靶向等位基因的频率，并追踪样本间的独特通讯，以在免疫健全的环境中跟踪原发性肿瘤和转移灶的体内冠状面演化过程。