一种用于评估甲型流感病毒血凝素亲和力与特异性的微型化聚糖微阵列检测方法

该微型糖芯片的总体目标是分析甲型流感病毒血凝素的特异性和结合强度。该检测方法有助于解答有关甲型流感病毒受体结合特性及结合强度的关键问题。该技术的主要优势在于，单次实验即可同时评估结合特异性及相对结合强度，而这一点通常无法在传统的糖芯片或基于微孔板的检测中实现。

本实验方案首先进行糖链样品的制备。糖链的基础溶液为储存用打印缓冲液，配制完成后应缓慢滴定至 pH 8.5，然后加入表面活性剂。使用配制好的打印缓冲液，将PAA偶联的糖链稀释至每毫升100微克。

然后，用点样缓冲液将单价糖链稀释至100微摩尔。最后，将胺基功能化染料配制成1微摩尔的工作液。现在，将每种糖链样品各10微升加入384孔微孔板的孔中。

此溶液量足以打印五张载玻片。同时，将十微升染料标记物转移至打印板的一个孔中。通过根据布局调整点样仪针头和打印头的位置，准备打印微阵列。

在此情况下，一个针头即可打印所有样品。糖链阵列以六个为一组进行打印，每组四周均留有空白区域。操作载玻片时需戴上手套。

用超高纯度的氮气吹去芯片表面的任何碎屑，然后将其展开。接着，将包被面朝上的芯片放置在点样仪的载物台上。然后，对点样仪进行编程。

本案例中，每次接触源板时，程序设置为 27 个点样位点。在聚-L-赖氨酸包被的载玻片的非阵列区域预先放置 3 个点样位点，用于去除针尖多余的液体。每次针头接触的其余 24 个点样位点，则用于在四个重复阵列中各放置 6 个点样位点。

具体细节请参见文本方案。现在将多孔板装入打印机，并开始打印阵列。打印过程中，确保湿度保持在55%至65%之间。注意观察聚-L-赖氨酸包被载玻片上预点样的外观。

打印完成后，目视检查每张载玻片。检查点样区域在聚四氟乙烯（Teflon）边框内的位置是否对齐，这一点至关重要；同时检查点样特征的数量是否正确。为了促进点样斑点的均匀附着，在载玻片制备完成后，应立即将其打印面朝上放入100%湿度的孵育 chamber 中。

使用湿润的纸巾铺在容器内并制作一个临时支架。用塑料膜包裹孵育室以保持湿度。半小时后，取出载玻片。

然后，使用耐溶剂标记笔对载玻片进行编号，并将其置于干燥箱中过夜保存。次日，通过剧烈搅拌配制新鲜的封闭缓冲液。使用浓氢氧化钠将pH值调节至9.2。

然后，将玻片在缓冲液中孵育1小时。为去除封闭液，用双蒸水冲洗玻片。接着，将玻片转移至玻璃染色架中，并将染色架放入摆动式板架内，以10 ×g离心5分钟使玻片干燥。

干燥后，如需保存，将载玻片置于密封的塑料袋中，在零下20摄氏度条件下储存。准备过程中，按之前方法再制备一个湿化室。为检测固定化的糖链，用探针缓冲液将SNA和ECA生物素化凝集素配制成每毫升10微克的浓度，并在每种稀释液中加入每毫升2微克的链霉亲和素555。

使用血凝素进行染色时，按照文本方案中所述的四比二比一摩尔比，用封闭缓冲液配制每毫升含20微克的预复合抗体溶液。将20微升配制好的溶液转移至384孔板的孔中。接着，用相应的缓冲液对凝集素和血凝素进行连续的一比一梯度稀释。

进行八次稀释，每个孔中加入10微升样品和10微升缓冲液。然后将酶标板置于冰上孵育30分钟。接着将每种稀释液各8微升分别加入打印好的载玻片上的48个微孔之一中。

然后，将制备好的载玻片放入湿盒中孵育90分钟。90分钟后，从载玻片边缘持握进行洗涤；将其在PBS-T中浸洗4次，再在PBS中浸洗4次，最后在去离子水中浸洗4次。接着，像之前一样进行甩干。

离心干燥后，立即扫描载玻片。务必以正确的方向小心地将载玻片放入扫描仪中。使用5毫瓦的低激光功率对载玻片进行逐次扫描，并逐步将增益从25%提高至75%。在优化扫描设置时需注意，反复扫描会导致荧光染料发生漂白。

使用相关软件分析保存的图像中的结合信号。可加载包含点样模式的阵列列表，并将其叠加到扫描图像上，以帮助确定网格标记的位置。

然后，使用软件分析斑点强度，并将结果保存为制表符分隔的文本文件，以便导入电子表格或其他统计软件包。通过计算平均信号强度减去背景值来分析数据。对每个样本的六个重复斑点中的四个取平均值，排除信号最高和信号最低的两个斑点。

然后，以八个蛋白质浓度为横坐标，以平均信号强度减去背景值为纵坐标，绘制折线图。使用非线性回归法对所得折线进行平滑处理。PAA 芯片阵列用于评估甲型流感病毒血凝素的受体结合特异性。

该芯片在同一微孔中包含了非唾液酸化的对照。使用已知对印迹化合物具有特异性的植物凝集素作为阳性对照。ECA凝集素可结合末端半乳糖β-1,4连接的N-乙酰氨基葡萄糖，但如果末端半乳糖被唾液酸封闭，则不与该相同化合物结合。

为了检测α2-6连接的唾液酸，使用了SNA凝集素。结果如预期所示，SNA仅结合α2-6连接的唾液酸，但对PAA连接与非PAA连接的染料标记lacNAc重复单元在亲和力上表现出显著差异。接下来，测试了一种源自越南/1203/04病毒的H5血凝素，该血凝素仅识别α2-3连接的唾液酸。

H5血凝素的结合谱显示了预期的特异性，对PAA连接的结构具有更高的亲和力。最后，测试了一株人季节性H1N1毒株的H1血凝素。正如预期，该血凝素仅与含有α2-6连接唾液酸的结构结合。

一旦掌握，该技术可在单次实验中揭示流感病毒的结合特异性及相对亲和力。该技术将显著提高流感结合实验的效率，同时减少珍贵生物试剂的消耗。