利用配备光学切片功能的解剖显微镜通过延时成像分析斑马鱼肾脏发育

本实验的总体目标是利用荧光体视显微镜，结合简单有效的重新对焦策略，对多种发育过程进行延时分析，以应对任意方向的漂移问题。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键科学问题，因为它能够在数小时内直接观察活体胚胎中组织和器官的发育过程。该方法的主要优势在于成本较低且操作简便，可作为激光扫描显微镜或光照显微镜等复杂技术的替代方案，用于发育中组织和器官的延时成像。

尽管该方法可提供关于扫帚鱼胚胎和幼体发育过程中时空变化的见解，也可用于研究其他模式生物的早期发育过程。此外，该方法适用于观察成体生物中的动态过程，例如根部愈合与再生。实验前，从表达转基因GFP的品系中筛选出具有高繁殖力的成年鱼。

在植物微注射前一日下午，将五对雌雄繁殖期的鱼分别放入五个繁殖容器中。在容器内，用可移动的筛网将雄鱼和雌鱼隔开，过夜饲养。次日早晨开灯后，立即把雄鱼和雌鱼一同放入筛网之上，以防止它们吞食所产的卵。

现在观察鱼类产卵。当亲鱼产下约50枚卵后，将其分开。然后用巴斯德吸管将卵转移至盛有胚胎用水的培养皿中，准备进行第一轮显微注射。

对每一对交配的个体重复此过程。如果需要更多卵，可将相同的交配对多次合并并分开。对于显微注射，培养皿和注射针的前期准备以较为标准的方式进行。

详细步骤可参见文本方案。首先装载一支已准备好的注射针。使用微量加样器吸头，从针尾注入 2 µL 的 MO 工作溶液，然后将注射针安装到显微操作仪上。

然后可以打开针尖。在体视显微镜下观察，用镊子夹住针尖末端将其撑开，或将其尖端抵住坚硬表面以打开。接着，通过将吗啉代寡核苷酸（MO）溶液注入刻度载玻片上的矿物油滴中，校准注射体积。

调整注射参数，使液滴直径为75微米，相当于约200皮升溶液。接下来，准备待注射的胚胎。将约21细胞期的胚胎沿显微注射培养皿的凹槽排列，使植物极朝向显微注射针的进针方向，进针方向与凹槽成45度角。

现在进行胚胎注射。用针头刺穿卵膜和卵黄，然后将加载的 Morpholino 溶液注入卵黄中。此方法适用于单细胞期或双细胞期的胚胎。

注射完所有胚胎后，使用宽口巴斯德移液管收集胚胎。将注射后的胚胎转移至含有胚胎培养液的培养皿中，并在28.5°C条件下孵育。当天下午晚些时候，用虹吸法移除死亡的胚胎，并更换胚胎培养液。

第二天早上，在胚胎经历原肠胚形成后，通过将胚胎水替换为含有微量PTU的胚胎水来抑制其黑色素化。注意：PTU在原肠胚形成之前会干扰胚胎的正常发育。随后，在目标发育阶段，使用尖头镊子去除胚胎的卵膜。

使用显微镜，用一对镊子夹住卵膜的一侧，再用另一对镊子尝试夹住卵膜的另一侧。然后小心地将镊子分开，注意不要损伤胚胎。接着用Tricaine对胚胎进行麻醉，并将胚胎与琼脂糖一同包埋，置于放置在盖玻片底部培养皿中的15微米定位网格上。

然后，将1毫升融化的琼脂糖分装至1.5毫升离心管中。将离心管放入设定为36摄氏度的加热金属块中，静置使其冷却。接着，使用宽口吸头，将胚胎转移至微型培养皿中。

吸去多余的胚胎液体，并在胚胎上覆盖琼脂糖。在琼脂糖仍处于液态时，使用两个细小的移液器吸头调整胚胎的方向。将目标结构（本例中为前肾）尽可能靠近玻璃底部，并使其位于网格附近。

网格不应覆盖目标结构。建议将最多四个胚胎分别嵌入不同的小培养皿中，并计划对其中状态最佳的一个进行成像。正确的包埋操作需要一定练习。

在琼脂糖仍处于液态时，必须将胚胎调整至所需的位置。如果目标是靠近玻璃底部的前肾，则应使其与重定位网格保持适当的距离。定期检查琼脂糖的状态。

当琼脂糖凝固至足以固定胚胎时，再静置两到三分钟。随后，用含有微量PTU和三卡因的胚胎水覆盖包埋的胚胎。倒出或吸走多余的胚胎水，并盖上盖子以防止蒸发。

结果不应含有任何气泡。现在可以将胚胎的玻璃底朝向物镜进行成像。若使用该样品进行延时成像，例如在数小时内定期采集Z轴层扫图像，则必须校正焦平面漂移。

如果可能，应用自动聚焦策略。在软件控制中切换自动聚焦选项。对于参考通道，选择透射光明场通道，以尽量减少光毒性。

为了确保自动对焦正常工作，选择一个足够大的标本相关搜索范围也至关重要。在采集图像之前，将印有网格的某个特定点移动至软件十字线附近的目标结构处，并通过截图保存该位置。然后，在每次成像时间间隔结束前，参考该截图，并重新调整载物台位置以及焦距（如果未启用自动对焦功能）。

本方法用于分析转基因斑马鱼品系中WT1A形态发生素敲低胚胎的肾脏发育。在早期肾生成过程中，该品系在肾脏前体细胞起源的中胚层区域呈现绿色荧光，随后在发育过程中的成管结构和肾单位原基中也可见荧光。延时成像显示，对照组注射Morpholino的胚胎中肾生成过程正常。

受精后20小时，发育中的前肾小管可见。在其前端顶端，可观察到代表正在形成的肾单位原基的球形细胞聚集。在随后的数小时内，小管和肾单位原基继续生长，原基开始在中线处融合。

相比之下，突变体中的肾发生过程受到严重破坏。尽管在受精后20小时仍可见GFP阳性管状结构，但这些结构弥散且发育不全。延时成像显示肾单位原基从未形成，大量位于发育中前肾以外的荧光细胞显著地向腹侧迁移，离开了前肾区域。

在进行本方案时，需注意缺乏额外设备（如温度控制装置或防蒸发台）的情况下，必须定期检查漂移情况并进行重新调整。按照本步骤处理后，可对成像的胚胎进一步实施其他方法，如免疫组织化学、原位杂交或实时荧光定量 PCR，以鉴定细胞或组织中的特定组分，或评估基因表达水平。