利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

本实验方案的总体目标是在光片显微镜中对斑马鱼胚胎的眼部发育进行成像，并通过Figi中的多视角重建应用程序插件处理所获得的多视角数据集。该方法可帮助您理解动物发育过程中的形态发生事件。该方法的主要优势在于，您可以在完整发育中的胚胎中以高空间和时间分辨率观察形态发生事件。

光片显微镜的主要优势在于该方法的光毒性较低，能够快速采集样本图像，并且可以从多个角度（即所谓的“视图”）对样本进行成像。从不同视角采集样本图像有助于我们克服信号衰减以及特定轴向上的成像限制。这些不同的图像随后可利用分布在样本周围的荧光微球进行整合与配准。

我们可以重建达到各向同性分辨率的三维体积。尽管我们以斑马鱼眼睛发育为例展示了光片荧光显微镜的使用，但该方法也可用于利用多种模式生物回答发育生物学和神经科学中的各种问题。首先，在保持照明物镜被遮盖的同时，将检测物镜旋入显微镜中。

然后，取下物镜的保护帽，小心地将样品室推入显微镜中。通过拧紧螺丝固定样品室。接着，将温度探头和帕尔贴模块连接到显微镜上。

用于珀尔帖模块冷却液循环的两根管路与两种连接器均兼容，且可在任意方向上工作。接下来，使用注射器通过注射器将溶液注入腔室，直至液面达到腔室窗口的上边缘，然后检查是否存在泄漏。现在，打开显微镜、计算机和培养箱。

启动显微镜操作软件，并将培养温度设置为 28.5 摄氏度。在温度平衡约一小时的同时，准备样品。首先配制琼脂糖。

将1毫升1%低熔点琼脂糖在E3培养基中于70摄氏度下融化。约15分钟后，将600微升熔化的琼脂糖转移至一个新的1.5毫升离心管中，加入250微升E3培养基、50微升0.4% MS 222和25微升涡旋荧光微球储备液。将离心管置于约39摄氏度的加热金属块中，使琼脂糖接近凝胶化温度。

接下来，将带有聚四氟乙烯（Teflon）尖端的推杆推至内径为1毫米的玻璃毛细管底部。准备五根这样的毛细管。随后，短暂涡旋混匀琼脂糖混合物，然后将五个胚胎连同最少体积的液体转移至其中。

然后插入毛细管，以头部朝前的方式吸取一个胚胎。必须确保头部先于尾部进入，且不能有气泡。吸入足够的溶液，使胚胎上方约有两厘米的琼脂糖，下方约有一厘米的琼脂糖。

在继续操作前，将一个胚胎吸入每根毛细管中。此步骤需要一定练习才能掌握，建议使用非珍贵胚胎进行前期准备。

当琼脂糖完全凝固后，用塑料泥将毛细管底部开口浸入溶液中，并将其固定在烧杯壁上，然后将样品置于 E three 培养基中保存。现在组装样品架。首先，将两个尺寸合适的塑料套管相对插入茎部。

袖筒上的狭缝必须朝外。接着，安装夹紧螺钉，并将毛细管插入支架，直至另一侧可见黑色色带。

避免触碰柱塞。然后拧紧夹具螺丝。接着，从毛细管中推出约一厘米的琼脂糖并将其切掉。

然后将样品杆插入样品台圆盘中。在装入样品盘之前，请检查控制软件中样品台是否处于最高位置。接着，利用导轨将样品杆和样品平稳地推入显微镜内。

现在，按照文本方案中所述对选定的样品进行成像。数据处理在 Figi 中完成，它是 ImageJ 的一个发行版本。

开始之前，应更新 Figi。将获取的图像数据集保存到一个单独的文件夹中。图像处理的中间文件将保存到同一文件夹中。

现在，启动多视角重建应用程序。然后，定义一个新的数据集。选择选项 Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats，并为输出数据文件创建一个名称。

然后选择数据集的第一个 CZI 文件，元数据将自动加载。在图像元数据中，仔细核对角度数量、通道数量、照明方式以及体素尺寸是否均已正确设置。

单击“确定”后，将打开一个日志窗口、一个视图设置资源管理器窗口和一个控制台窗口。视图设置资源管理器提供了用户友好的界面。选择需要处理的文件，然后单击鼠标右键。

一个新窗口将打开，显示各个处理步骤的执行过程。窗口右上角为信息和保存按钮。信息按钮可显示已保存数据文件内容的摘要，点击保存按钮将保存处理结果。

否则，程序不会保存处理步骤的结果。要重新保存整个数据集，首先按 Ctrl+A 并使用右键单击来选择所有文件，然后选择“重新保存数据集”并选择“另存为 HDF5”。

必须勾选确认重新保存操作。几分钟后，程序将针对每个时间点提示重新保存已完成。随后，继续进行数据中兴趣点的检测。

按住 Ctrl+A 并单击右键，选择所有时间点。选择并检测兴趣点。在选项中选择高斯差分（difference-of-gaussian）。

并在分割前选择并降低样本图像的分辨率。在下一个窗口中，选择检测设置。在亚像素定位选项中，选择三维二次拟合。

然后，在兴趣点设置中选择“交互式”。对于XY方向的下采样选项，选择“匹配Z轴分辨率”；对于Z轴下采样，选择1倍。

然后，通过选择“在 CPU 上运行 Java”选项来执行操作。在弹出的窗口中，选择一个视图以测试参数。视图加载完成后，按键盘上的 Ctrl+Shift+C 调整亮度和对比度。

此外，对于珠子检测，请切换“查找最大值”绿色选项。现在观察检测结果周围以绿色环显示的分割情况。调整高斯差分的 sigma 1 和阈值参数，以实现对珠子的最佳分割，并使假阳性数量最少。

每个微珠只能被检测一次。确定最佳参数后，点击“完成”。计算机加载后，程序会针对每个时间点的各个视野分别分割微珠，并输出一个日志文件，记录每个视野中检测到的微珠数量。

每个视野中应有 600 至数千个微珠。否则，需要调整检测参数。此过程较为复杂。

检测金字塔首次尝试时很少能准确，且在一部影片的不同时间点之间重置次数可能有所不同。适当放宽阈值可检测到所有真实微珠，尽管可能会增加一些假阳性结果，但有助于提高检测效果。如果金字塔参数的任何组合均无效，则必须使用不同的荧光微珠重新获取一组新的数据。

现在开始对检测结果进行配准，并从图像序列中生成多视角去卷积图像。光片荧光显微镜（LSFM）是一种理想的成像方法，可用于长时间观察从细胞间结构、单个细胞到整个组织等多个尺度的发育过程。一些非常快速的细胞间事件也可以高分辨率地被捕获，例如神经前体细胞中微管的生长。

通过单视角动态影像，可以对微管的生长进行定量分析。细胞内结构可被长时间追踪，例如视网膜神经节细胞中的中心体。可以从整个组织图像中提取单个细胞的行为信息，例如神经节细胞在视网膜上的迁移过程。

多视角反卷积通过结合多个不同视角并利用点扩散函数，生成一个各向同性的Z轴图像序列。与单视角图像或加权平均融合相比，该方法可显著提升成像质量。例如，可通过本数据集在不同方向上的光学切片，研究视泡转变为视杯的过程。

此外，整体良好的成像质量显而易见，即使在胚胎深层区域也是如此，例如观察视杯形态发生过程时。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在光片显微镜中制备并固定斑马鱼胚胎样本进行成像。

以及如何在 Figi 中处理多视角数据集。一旦掌握，启动光片显微镜上的延时成像实验大约需要两小时。后续的数据分析则需要更长的时间。

对于该任务，使用计算机集群可能会更有利。更多实用技巧、故障排除建议以及其他资源链接可在文字版实验方案中找到。实验前必须具备足够的存储容量，并提前制定清晰的数据处理流程计划。

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