小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的总体目标是促进对多发性硬化症发病机制中潜在分子机制的研究。该方法有助于回答多发性硬化症领域中的一些关键问题，例如：免疫细胞在疾病发展的哪个阶段浸润中枢神经系统？该技术的主要优势在于，EAE模型模拟了多发性硬化症的许多主要特征，例如脱髓鞘和免疫细胞浸润。

该技术的应用前景涉及多发性硬化症的治疗，因为利用此方法测试的药物已有被批准用于该疾病。通常，刚接触此方法的研究人员可能会遇到困难，因为在诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）时必须充分考虑多种条件。小鼠必须饲养在无应激环境中，且百日咳毒素应新鲜配制。

该方法的官方演示至关重要，因为仅通过文字描述难以掌握淋巴结的分离和脊髓的提取操作。首先，在10至13周龄的雌性小鼠皮下注射200微克髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，该蛋白用含400微克结核分枝杆菌的200微升完全弗氏佐剂乳化。

在注射后立即以及24小时后，向小鼠腹腔内注射含有0.2微克百日咳毒素的200微升PBS溶液。在诱导EAE之前，必须使小鼠适应操作处理和实验环境，以减少应激反应，因为应激可能抑制临床症状的发生。注射后一周，按照下表所述每日观察小鼠的临床症状。

为评估诱导EAE后淋巴结的免疫细胞群体，在诱导后的适当时间点，用80%异丙醇润湿切口区域，小心去除髋部区域的皮肤。使用镊子从脂肪组织中仔细分离出腹股沟淋巴结。随后称量淋巴结重量，并将样本置于冰上PBS中。

为了分析脊髓细胞，先用异丙醇润湿动物背部，然后使用解剖刀沿脊柱纵向切开。接着去除皮肤，分离出支配后肢的腰段脊柱部分。用装有磷酸盐缓冲液（PBS）的注射器冲洗脊柱，以提取脊髓组织。

切除约1/3的腰段脊髓后，称量脊髓组织片段，并将组织置于冰上PBS中保存。为分析脾脏免疫细胞群体，切开组织以暴露腹腔下部。随后取出脾脏，并剪下约1/8的组织。

称重脾脏组织片段，并将组织置于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。然后使用一支2 mL注射器的推杆，将剩余组织通过置于50 mL离心管上的70微米细胞筛网研磨成匀浆，随后用5 mL PBS冲洗滤网。离心过滤后的细胞悬液。

将沉淀重悬于500微升细胞裂解缓冲液中，并将细胞转移至1.5毫升离心管中。室温孵育10分钟后，用500微升PBS洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于含0.2% BSA的100微升PBS中，并向细胞中加入2微升Fc受体1封闭缓冲液。

室温避光孵育15分钟后，加入13微升抗体混合液，继续在室温避光条件下标记细胞15分钟。孵育结束后，用500微升PBS至少洗涤细胞两次，将最终的细胞沉淀重悬于500微升新鲜PBS中。然后将细胞转移至流式管中，置于冰上。

最后，为了通过流式细胞术分析样品，在进行流式细胞术检测前立即向细胞中加入30 µL流式细胞术绝对计数标准品，以确定细胞的绝对数量。然后在流式细胞仪上分析样品。如图所示，在EAE诱导的急性期，淋巴结内所有免疫细胞群体均出现短暂性增加。

然而在脾脏中，只有巨噬细胞、B细胞、T细胞和中性粒细胞表现出浸润增加。在血液中，所有免疫细胞群体在临床前阶段均表现出外周循环的短暂升高，这与疾病急性期腰段脊髓中类似的疾病依赖性升高相对应，但单核细胞群体除外，后者可能在进入脊髓后分化为巨噬细胞。此处展示了用于评估不同细胞群体的设门策略。

细胞数量与所分析的组织量或血容量相关，反映了细胞的绝对计数。在淋巴结中，IL-23 mRNA 的表达在临床前阶段升高，而 IL-6 的表达则随疾病进展而增加。在脾脏中，IL-6 和 IL-23 的表达在临床前阶段即升高，而 IL-1β mRNA 的表达则直至疾病发作后才受到影响。

在血液中，仅有 TNF-α mRNA 的表达上调，且其上调方式依赖于疾病状态。在腰段脊髓中，TNF-α、IL-1β 和干扰素 γ 在疾病的急性期被诱导表达，而 IL-6 仅在疾病 onset 期出现上调。若操作熟练，正确完成 EAE 模型构建、后续细胞分离及效应分析，十只小鼠的全部流程可在八小时内完成。

完成此操作后，可进行其他方法（如蛋白质印迹或ELISA）以验证mRNA表达分析的结果。该技术建立后，为多发性硬化症领域的研究人员探索中枢神经系统脱髓鞘机制提供了途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何诱导EAE模型，以及如何分离免疫细胞以获得可重复的流式细胞术结果。

请注意，使用完全弗氏佐剂可能具有极高危险性，在进行此操作时应采取预防措施，例如提起小鼠的皮肤，并确保注射器完全穿透皮肤。