从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

为了研究多发性硬化等自身免疫性疾病的分子和细胞机制，目前迫切需要建立可重复且精密的细胞分离方案。现有的大多数用于分离和分析中枢神经系统驻留细胞的技术均存在严重缺陷，例如仅针对单一细胞类型或仅适用于出生后小鼠。本方案可从单个中枢神经系统样本中同时分离所有主要的中枢神经系统驻留细胞类型，从而能够在体外分析复杂的神经元网络以及新的炎症通路，所获得的单细胞悬液适用于健康小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型。

此外，小鼠数量有所减少。我们建立的在健康和EAE小鼠中同时分离四种主要中枢神经系统常驻细胞类型的方案，可作为研究新型炎症通路的研究团队的有用工具，从而实现对复杂的生物分子机制和细胞网络进行更为精确的离体分析。借助本方案可回答的新科学问题包括在EAE疾病进程的不同阶段（如神经炎症、神经退行性变和缓解期）进行动态研究。

此外，还可以在单细胞水平上研究细胞间的相互作用和生物化学通路。同样，可对培养的细胞进行功能检测。我们计划针对每个EAE时间点的单个中枢神经系统匀浆样本，开展多组学分析，重点关注EAE病程的动态研究。

首先将小鼠置于仰卧位，并用针固定四肢。在动物体前部涂抹75%乙醇。沿腹部和胸部的皮肤及筋膜做纵向切口。

沿胸骨旁剪断肋骨，向上翻起胸廓以充分暴露心脏。用针固定上翻的胸廓。用剪刀剪开右心房。

使用套管，将20毫升的单倍磷酸盐缓冲液（PBS）注入左心室，通过剪开的右心房冲洗血液。沿小鼠头部顶端的皮肤做纵向切口，暴露颅骨，并用镊子将头部周围的皮肤移开。借助剪刀沿矢状缝剪开颅骨。

沿切口线插入剪刀尖端，以打开颅盖。用镊子移除颅盖的剩余部分，使脑组织完全暴露。小心取出脑组织，并将其放入小鼠脑切片模具中。

使用剃刀将脑组织切成一毫米厚的矢状切片。用剪刀在髂嵴上方剪断脊柱。将连接有20毫升PBS溶液的一次性20号针头插入脊髓腔内。

从尾端向头端将脊髓从脊髓腔中冲洗出来。使用解剖刀将脊髓切成每段0.5厘米长的小段。将包含脑组织和相应脊髓的中枢神经系统细胞悬液置于含有3毫升冷DPBS的培养皿中保存。

首先，解剖脑和脊髓组织，并将细胞悬液置于冰上保存。然后，配制适量的酶混合液一和酶混合液二。取1950微升酶混合液一加入C管中，再加入中枢神经系统细胞悬液的组织碎片。

然后向 C 管中加入 30 µL 酶混合液二。将 C 管盖紧，并倒置固定在带加热器的细胞解离仪套筒上。运行相应的程序，并观察至少 5 分钟，以确保所有管子以相同的速度旋转。

在此期间，将一个70微米的滤网置于50毫升离心管上，并用2毫升DPBS预湿滤网。程序结束后，从解离装置上取下C管，将样品在4摄氏度下以300 ×g离心1分钟。重新悬浮样品，然后将其加入预湿的滤网中。

向空的 C 管中加入 10 毫升冷 DPBS，混匀，然后将悬液加入对应的滤筛中。弃去滤筛后，再次离心细胞悬液 10 分钟，然后小心吸除上清液以获得细胞沉淀。首先，在解离中枢神经系统组织后获得细胞沉淀，并将其用 3100 微升 DPBS 重悬于一个 15 毫升离心管中，切勿涡旋振荡。

向两份合并的中枢神经系统细胞悬液中各加入1800微升成年动物脑组织解离试剂盒中的碎片去除液。轻轻颠倒离心管以混匀悬液，然后缓慢地在每份悬液上层铺加4毫升预冷的DPBS，观察形成清晰的梯度界面。将离心管在4°C条件下以3000 ×g离心10分钟，加速度设为最大，不启用刹车功能。

离心后形成三层。完全吸除上层两相并弃去，确保无髓鞘残留。用预冷的DPBS加至14毫升，然后关闭管盖。

用力将离心管倒置在实验台面上，直至细胞沉淀从管底脱离。离心样品并彻底吸除上清液。如需去除红细胞，请向细胞沉淀中加入1毫升红细胞去除溶液。

重悬沉淀后，在4°C下孵育溶液10分钟。然后加入10毫升冷的PB缓冲液，离心样品，并彻底吸除上清液。细胞计数时，先用PB缓冲液将细胞悬液稀释50倍，再用0.4%台盼蓝溶液进行1:10稀释。

然后使用改良的计数室测定细胞数量。首先，将纯化后的未稀释小鼠中枢神经系统细胞悬液分为两份，用于进一步分离小胶质细胞和少突胶质细胞。然后，向相应的细胞悬液中加入针对不同中枢神经系统细胞类型表面抗原的磁性标记微珠。

将柱子置于磁场中，平衡柱子，然后将所得的细胞悬液加到柱子上。磁标记的细胞将被保留在柱子内，而未标记的细胞则会流过。将柱子从磁场中移开后，用缓冲液将磁标记的细胞从柱子中冲洗出来，收集到离心管中，作为正向筛选的细胞组分。

将少突胶质细胞的阴性流过部分分为两份，用于进一步分离神经元和星形胶质细胞。利用细胞类型特异性标记物结合活/死细胞区分进行流式细胞术分析，获得小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。对不同细胞群体的表型鉴定证明，所有主要中枢神经系统常驻细胞类型均获得了纯度和活性均约为90%的单细胞悬液。