正常小鼠70%部分肝切除术后血管与实质再生的可视化

正常小鼠70%部分肝切除术后血管和实质再生的可视化。传统上，肝脏再生通过测量肝脏重量和体积的增加以及确定肝细胞增殖率来评估。如今，我们关注小鼠肝脏血管再生，希望对血管生长进行可视化和定量分析。

因此，我们建立了血管再生成像的工作流程。该流程包括四个步骤：血管树的对比显影、CT 扫描采集、三维重建以及对所得图像进行定性和定量分析。工作流程首先从血管树的对比显影开始。

首先暴露肝脏，可以是正常的或已切除的肝脏，然后根据感兴趣的血管系统，将聚合硅胶造影剂注入门静脉或肝静脉。接着，将离体肝脏进行MicroCT扫描。扫描完成后，我们使用Imalytics preclinical软件进行三维血管重建。

如果所获得图像的技术质量足够好，则可以使用 HepaVision 进行三维重建。该程序在临床上用于肝胆外科手术的规划。除了对血管树进行三维可视化之外，该程序还可基于供血和引流血管，实现对肝脏总体积及各叶体积的可视化与计算。

重建后，我们可以借助计算技术确定更多反映血管生长的参数，例如特定血管的长度和直径，从而实现对血管生长的定量描述。另一方面，经甲醛固定的Microfil样本可被切成连续切片。

可以使用全片扫描仪对连续切片进行染色和数字化。在完成连续切片的刚性与弹性配准后，可重建门静脉系统和肝静脉系统的三维血管树。下一步，我们希望探究分子事件的空间分布特征。

肝脏再生研究中一个值得关注的分子事件是增殖标志物 Ki-67 在肝细胞核中的出现及其在三维重建的血管树中的空间分布。接下来，我们将详细介绍如何进行 Microfil 注射，以及试剂的准备。

对于Microfil化合物混合物，我们需要MV稀释剂、MV化合物（在本实验中为蓝色的MV-120）以及固化剂。此外还需要移液管、离心管和移液器。在一个5毫升离心管中准备2毫升的MV-120。

然后加入3毫升MV稀释液进行稀释，轻轻振荡混匀。对于肝素生理盐水溶液，将1毫升肝素加入10毫升生理盐水中。

准备手术台。首先，需要一台显微镜；其次，需要一套耗材：6-0 丝线和 6-0 聚丙烯缝合线、5 毫升和 1 毫升注射器、30 号和 21 号针头、用于连接注射器与导管的延长管、带针芯的 26 号导管、棉签和纱布。

第三，需要手术器械。包括显微器械、钳子和电凝器。第四，需要灌注泵。

准备动物。将小鼠放入麻醉诱导室，使用2%异氟烷和0.3毫升/分钟氧气进行麻醉。用胶带将麻醉后的小鼠固定在手术台上，持续吸入2%异氟烷和0.3毫升/分钟氧气。

微丝注射，门静脉系统。使用剪刀在腹部做横向切口，皮肤层用剪刀，肌肉层用电凝器。用棉签将肠管移至左侧，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖肠管。

在显微镜下解剖门静脉。在门静脉分叉处约1毫米距离的肝外段门静脉下方放置6-0丝线。先松扎，以备后续使用。

通过阴茎静脉注射肝素生理盐水溶液，持续五分钟以实现全身肝素化。此动画将演示导管插入的操作步骤。首先，在肝外门静脉下方放置6-0丝线缝合线，然后将26号导管插入门静脉，并使用夹钳固定。

结扎预先放置的缝线，以固定导管并阻断来自脾静脉和肠系膜静脉的血流。接下来我们将演示手术操作步骤。插入带有针头的26号导管。

继续插入导管，同时缓慢退出针头。使用夹子固定导管。用肝素生理盐水溶液完全充满导管，以避免产生气泡。

将延长管连接至导管并牢固固定。打开灌注泵，以0.4毫升/分钟的流速开始肝素化生理盐水灌注。

灌注后立即观察右叶是否变苍白。在整个灌注过程中，使用生理盐水冲洗肝脏以保持其湿润。在麻醉状态下通过灌注放血处死小鼠。

继续肝素灌注数分钟，直至整个肝脏变为苍白色。在进行Microfil灌注前，向已配制好的Microfil溶液中加入0.1毫升固化剂，以加速聚合过程。将Microfil溶液装入5毫升注射器及延长管中。

通过向导管内注射肝素盐水溶液来排出气泡，方法与之前相同。将导管与管路连接并牢固固定。以每分钟0.2毫升的流速开始注射Microfil，持续约一到两分钟。

观察蓝色示踪剂缓慢扩散至门静脉分支。当每个肝叶表面出现蓝色血管结构时（如红圈所示），停止灌注。让肝脏静置至少15分钟，以使Microfil化合物充分聚合。

微填充剂注射，肝静脉系统。该操作的基本步骤与门静脉系统注射相同。在门静脉分叉处约一毫米距离的肝外门静脉下方放置6-0丝线缝合线。

然后将导管插入门静脉，并用夹子固定。将另一根导管插入下腔静脉，同样用夹子固定。结扎预先放置的缝线，以固定导管并阻断来自脾静脉和肠系膜静脉的血流。

在肝上段下腔静脉处放置血管夹，以阻断肝脏的血液流出。结扎下腔静脉的分支，包括双侧肾静脉及下腔静脉远端。通过导管一用肝素生理盐水溶液灌注肝脏。

通过导管二向肝静脉系统灌注Microfil造影剂。结果：Micro CT重建。在Micro CT扫描后，我们使用Imalytics preclinical软件获得了三维血管重建图像。

门静脉系统和肝静脉系统的血管再生表现为主要血管结构的延长和增宽，并伴有小血管的分支延伸。术后第2天，残余肝叶的血管树出现延长。至术后第7天，源自同一主门静脉和肝静脉的额外小分支变得可见。

结果，肝脏血管树及其相应肝区域的三维彩色编码重建。通过HepaVision进行彩色编码重建后，可在三个维度上清晰显示每个肝叶。如表中所示，已测定全肝及各肝叶的肝体积，此处展示的是正常肝脏肝静脉系统的测量结果。

结果、连续切片与重建。另一方面，将经甲醛固定的Microfil样本进行连续切片。染色后的连续切片使用全片扫描仪数字化，并用于两个系统的血管树重建。

这些是小鼠肝脏连续切片在刚性与弹性配准前后的横截面图像。经过计算机配准后，门静脉系统和肝静脉系统可在单个三维模型中重建。这一手动及计算耗时的步骤仍需进一步优化。

下一步，即分子事件在血管树结构中空间分布的可视化，目前正处于开发阶段。该步骤可设想为将来自造影增强血管树的显微CT信息与组织学信息相融合，或对纯组织学信息进行三维可视化。在此情况下，显微CT信息将作为基于组织学的复杂三维重建的质量控制手段。

一旦实现，我们将获得一种更佳的工具，用于深入研究肝脏再生，特别是分子事件的空间分布以及肝实质与血管再生之间的关系。