一种快速处理血液以提高人血浆肽水平得率的方法

该 RAPID 方法的总体目标是提高人血中内源性肽类激素的检测得率。RAPID 方法最近已在大鼠中建立，同样适用于人血样本。该方法可提高检测得率，并能够准确检测内源性肽类激素的分子形式。

RAPID 方法易于使用。然而，与标准采血方法相比，RAPID 方法耗时更长且成本更高，因此可能更适用于研究环境。

该方法的可视化演示至关重要，因为样本的及时稀释以及洗脱对于确保适当的肽水平极为重要。应在隔夜禁食后于标准化时间从前臂静脉采集静脉血，并根据标准程序或RAPID方法进行处理。

指导受试者在采血前不要进行运动或吸烟。进行标准处理时，将血液采集至含有预冷EDTA的试管中，并在10分钟内于4°C条件下以3000 ×g离心10分钟。收集上清液，并于-80°C保存，直至进一步进行放射免疫分析。

对于 RAPID 处理，立即将血液在冰上用 RAPID 缓冲液按 1 比 10 稀释。缓冲液 pH 为 3.6，含有 0.1 摩尔醋酸铵、0.5 摩尔氯化钠以及酶抑制剂。

在10分钟内，将RAPID样品在4摄氏度下以3000 ×g离心10分钟，并使用移液器收集上清液。接下来，以每分钟10毫升的速度用100%乙腈对层析柱进行活化。随后用0.1%三氟乙酸（TFA）平衡。

使用注射泵以每分钟1毫升的恒定流速加入RAPID样品上清液。用3毫升含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液以每分钟10毫升的流速洗涤小柱后，再以每分钟2毫升的流速用2毫升含0.1% TFA的70%乙腈缓慢洗脱RAPID样品。将洗脱的样品通过真空离心干燥，并于-80摄氏度保存，待后续进行放射免疫分析。

获取碘-125放射性标记的人源肽。在实验前将肽保持粉末状态，实验时用0.1%乙酸新鲜稀释。

标准处理时，在采血后立即取1毫升血液，加入含有50微升放射性标记物（含3000至6000 CPM）的预冷EDTA抗凝管中。快速处理（RAPID）时，取1毫升含EDTA的血液，转移至含有9毫升RAPID缓冲液和500微升放射性标记物（含30,000至60,000 CPM）的试管中。由于进行了1:10的稀释，RAPID处理需使用比标准处理高10倍体积的放射性标记物。

在应用 RAPID 方法的各个步骤后，立即使用γ计数器评估放射性标记肽的回收率。切勿通过真空离心干燥样品，也切勿在 -80 °C 下保存。测量时，将上清液转移至适合放入γ计数器的试管中。

并测定每分钟的计数。在标准样品中，测量全部上清液。在 RAPID 样品中，分析总体积的十分之一，以获得相当的放射性标记用量。

作为100%标准，使用两个样品，每个样品含有50微升碘-125放射性标记的肽，不进行任何处理。同时测量所有样品的放射活性。采集血液至预冷的含EDTA试管中，并将1毫升血液转移至含有200微升放射性标记酰化胃饥饿素（CPM值为15,000至20,000）的试管中，用于标准处理。

对于快速处理，将1毫升血液转移至含有9毫升快速缓冲液的试管中，并加入200微升放射性标记的酰化胃饥饿素，其放射活性为15,000至20,000 CPM。随后，按之前方法处理样品。若需进一步通过反相高效液相色谱分析，可直接将样品上样至已用含0.1%三氟乙酸的17%乙腈水溶液平衡的稳定键合C18柱。

平衡5分钟后，以每分钟1毫升的流速，使用17%至40%乙腈的梯度在40分钟内洗脱样品。每分钟收集1毫升的组分，并使用γ计数器分析放射活性。在另一项实验中，直接将含有15,000至20,000 CPM的200微升放射性标记的酰化胃饥饿素上样至色谱柱，并按前述方法进行高效液相色谱分析。

进行放射免疫分析时，将冷冻的上清液和真空干燥的粉末在室温下解冻。在进行放射免疫分析前，立即根据血浆的原始体积，用双蒸水重新溶解干燥的 RAPID 样品。使用商业放射免疫分析试剂盒，按照生产商的说明书检测吻素（kisspeptin）、总胃饥饿素（total ghrelin）以及酰化胃饥饿素（acyl ghrelin）。

使用可形成稳定包被的硼硅酸盐管。第一天，将样品与检测试剂缓冲液及一抗混合，按照制造商提供的稀释比例孵育24小时。第二天，加入碘-125标记物，涡旋混匀后继续孵育24小时。

第三天，加入沉淀试剂，涡旋混匀，并按照试剂盒说明书推荐的条件进行孵育。随后，在4°C条件下以3,000 ×g离心20分钟。弃去上清液，使用γ计数器测定沉淀物中的放射性活度。

通过总胃饥饿素减去酰基胃饥饿素，计算去酰基胃饥饿素含量。通过将每个样本的酰基胃饥饿素除以去酰基胃饥饿素，计算酰基/去酰基胃饥饿素比值。如果可能，应将所有样本在同一批次中进行处理，以避免不同批次检测之间的变异。

与标准血液处理相比，快速（RAPID）血液处理可提高人血中碘-125标记肽的回收率。经过标准血液处理后，九种肽的放射性标记肽回收率范围为48%至68%。RAPID处理显著提高了所有碘-125标记肽的回收率，回收率范围达到71%至98%。图中显示了在标准或RAPID血液处理后，人血中碘-125标记的酰化饥饿素（acyl ghrelin）的洗脱曲线。

经过 RAPID 处理后，碘-125 标记的胃饥饿素在预期位置被洗脱。而经过标准程序处理后，观察到一个更早的峰，可能对应于去酰基胃饥饿素。

这代表肽降解了62%。与标准处理方法相比，快速（RAPID）血液处理可改善酰化与去酰化饥饿素的比例。经过快速处理后，正常体重受试者血液中酰化与去酰化饥饿素的比例为1比3。

与标准血液处理后的1至23相比，在厌食和肥胖条件下也观察到类似结果。快速血液处理与标准处理相比，可导致内源性kisspeptin血液水平升高。

在神经性厌食症患者和正常体重受试者中，RAPID 处理后的循环内源性kisspeptin水平均显著高于标准处理方法。在肥胖条件下，这种差异未达到统计学意义。一旦掌握并正确操作，该技术可在一小时之内完成。

当肽的预期浓度较低或组间差异较小时，该方法尤为重要。无法对肽提供通用的建议，每种肽的潜在优势都应在实验初期进行一次测试。

该技术为不同领域的研究人员探索内源性肽类激素的产量以及更为重要的正确分子形式铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在人体血液处理中应用 RAPID 方法。