快速磁珠法高效纯化低密度中性粒细胞

我们研究外周血单个核细胞中的低密度中性粒细胞，以表征其功能并明确其在不同疾病中的作用。低密度中性粒细胞在健康人血液中较为罕见，但在系统性红斑狼疮和癌症等疾病中会显著增加。首先，在15毫升锥形离心管中加入每毫升10单位的肝素作为抗凝剂。

然后加入2毫升含6%葡聚糖T500的PBS溶液。通过静脉穿刺从一名健康成年志愿者采集10毫升血液。在另一支新的15毫升离心管中，加入5毫升密度梯度介质。

小心地用移液管吸出血浆，避免接触红细胞，并将其叠加在培养基上方，形成两个分离的相。在4°C条件下，以516 ×g离心20分钟。为分离PBMCs，吸取并弃去PBMC层上方的血浆，注意不要扰动细胞层。

收集血浆与培养基之间的单个核细胞层，尽量避免吸出培养基。向含有外周血单个核细胞（PBMCs）的离心管中加入20毫升磷酸盐缓冲液（PBS），然后在4°C条件下以400 ×g离心5分钟。小心吸除上清液，并轻轻刮擦管壁以充分分散细胞沉淀。

加入10毫升冷的PBS重悬细胞。为分离中性粒细胞，在吸出培养基后刮擦离心管以使细胞脱离管壁，然后加入10毫升冷的PBS。

现在将细胞转移至一个新的50毫升锥形离心管中，进行离心。吸除上清液，并再次刮取管壁。然后用移液器向管中加入10毫升冷的低渗溶液，轻轻混匀。

轻轻混匀，持续时间恰好为一分钟。迅速加入10毫升冷的高渗溶液，使溶液变为等渗。然后使用Neubauer计数板对中性粒细胞进行计数，并确保纯度大于95%。离心悬浮液以获得细胞沉淀。

然后将沉淀重悬于冷的PBS中。在4°C条件下，以400 ×g离心外周血单个核细胞5分钟。去除上清液后，将细胞重悬于120 µL冷洗涤缓冲液中。

然后向细胞悬液中加入35微升CD66b磁珠。将混合物在4摄氏度避光孵育30分钟。现在向离心管中加入1毫升冷洗涤缓冲液。

在400 ×g下离心3分钟。移除上清液后，刮擦管壁以分离细胞沉淀，并将细胞重悬于1毫升洗涤缓冲液中。

将磁性分离柱置于磁铁上。向柱中加入0.5毫升洗涤缓冲液，使其完全流过。将1毫升重悬的细胞转移至柱中，让缓冲液逐滴流过。

洗涤后，将层析柱转移至微量离心管中。然后用移液器向层析柱中加入一毫升洗涤缓冲液。现在将推杆插入层析柱顶部。

轻轻施加压力以洗脱细胞。然后取出柱塞，将柱子置于新的微量离心管上。向柱子中加入1毫升洗涤缓冲液。

然后重新插入推杆，轻轻施压以洗脱剩余的细胞。将两个微量离心管在800 g下离心3分钟。将两个管中的细胞沉淀重悬于1毫升冷的PBS中。

将细胞悬液置于冰上。用含1%胎牛血清的PBS缓冲液重悬纯化的细胞。取250微升悬液转移至1.5毫升微量离心管中。

向试管中加入针对中性粒细胞膜分子的相应抗体。然后在避光条件下于4°C孵育细胞30分钟。现在向试管中加入1毫升PBS。

在微量离心机中以800 ×g离心3分钟。吸去上清液。轻敲离心管以打散沉淀。

将细胞重悬于0.5毫升1%多聚甲醛中。然后将细胞置于4°C避光保存，直至进行流式细胞术分析。使用流式细胞术分析样品，每份样品采集10,000个事件。

健康个体中的低密度中性粒细胞约占外周血单个核细胞的5%，而所描述的磁分离方案可获得约98%回收率的低密度中性粒细胞。中性粒细胞表达膜标志物CD10、CD11b、CD15、CD62L和CD66b。经磁珠纯化的低密度中性粒细胞表达与中性粒细胞相同的膜标志物。

纯化的低密度中性粒细胞具有多叶核，其大小与中性粒细胞相似。中性粒细胞和低密度中性粒细胞在PMA刺激下均可产生活性氧，其中低密度中性粒细胞产生的水平高于中性粒细胞。在PMA刺激下，低密度中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网，表现为DNA与弹性蛋白酶及瓜氨酸化组蛋白共定位。

经PMA处理后，纯化的中性粒细胞和低密度中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的速率和量相似。本方案提供了一种快速且可重复的方法，用于获得高纯度且功能完整的低密度中性粒细胞。我们解决了从人血液中分离低密度中性粒细胞缺乏标准化、省时的实验方案这一问题。

本方案无需对复杂仪器进行特殊培训，且比荧光激活细胞分选（FACS）更经济、更快速。