高内涵筛选分析用于评估有害及潜在有害成分（HPHC）的毒理学效应

该方法结合了基于阻抗的实时细胞分析仪和基于高内涵筛选的平台，其总体目标是提供有关有效剂量、毒性和生物学效应的信息，以获得受试化合物的毒性特征（Tox Profile）。该方法有助于回答毒理学领域的关键问题，例如细胞毒性、基因毒性和细胞应激反应等。

此外，该方法不仅能同时提供多种生化和形态学参数的信息，还可应用于多种不同类型的细胞及细胞培养模型。由于管辖权限和条件限制，整个操作过程将仅针对一段较短的化合物进行评估。出于相同原因，仅展示一种实验方案以演示高内涵筛选评估。

演示该实验步骤的是来自本实验室的技术人员 Stefano Acali 和 Alexander Laurent。为观察正常人支气管上皮细胞（即 NHBE 细胞），需对仪器进行编程以设定阻抗测量的次数和持续时间。本研究中，每 15 分钟记录一次数据，持续 48 小时。

通过移液将50微升预热的培养基加入96孔RTCA板的每个孔中，以测量板的背景值。此步骤是仪器计算培养基电学电阻所必需的技术环节，该电阻将作为基于细胞计算的基线参考值。随后，向RTCA板各孔中已有的培养基中加入50微升浓度为144,000个细胞/毫升的细胞悬液。

细胞加热后，必须将培养板在室温下静置40分钟，以使细胞充分贴壁并获得均匀的细胞分布。将RTCA培养板放入培养箱中的底座内孵育，并在给药前开始记录数据，持续24小时，允许±2小时的偏差。对于阳性对照，用DMSO将10毫摩尔的星形孢菌素储备液按1:10比例稀释。

取5微升稀释液加入195微升培养基中，得到5倍工作溶液。对于有害和可能有害的组分，将每种组分溶解于载体中，配制成1摩尔的储备液。然后，将每种待测物质的储备液在培养基中按1:10稀释，得到100毫摩尔的溶液。

通过先向B至F孔中加入含10%溶剂的培养基，再向A孔中加入100毫摩尔溶液，制备化合物主母板。进行五步1:10倍比稀释，以获得5倍工作液。给药时，暂停RTCA仪器，打开支架取出暴露板，并将该板置于RTCA温控工具中，以避免细胞冷却，从而影响阻抗测量。从化合物主母板中取25微升5倍溶液，按照化合物主母板中的相同加药顺序，以三复孔形式加入细胞中。

不要移除现有的细胞培养基。然后，在不移除现有培养基的情况下，向底部一行右侧的细胞中加入25微升5倍浓度的阳性对照溶液。同样，向底部一行左侧的细胞中加入25微升培养基。

使用酶标板封板机密封酶标板后，将酶标板重新放回RTCA仪器的板架中并锁定。重新启动数据记录，持续至设定的暴露时间。数据记录完成后，分析RTCA细胞活力数据，以确定用于高内涵筛选（HCS）分析的待测物质。

在本实验中，选择1-氨基萘、砷、铬和巴豆醛进行高内涵筛选分析。为观察原代人支气管上皮细胞（NHBE细胞），将100微升细胞悬液（浓度为每毫升120,000个细胞）加入96孔黑色培养板的每个孔中。将高内涵筛选板在室温下静置30分钟，使细胞贴壁，随后在37摄氏度、5%CO2条件下孵育24小时（±2小时），然后进行给药处理。

对于阳性对照，在第二列中加入每种阳性对照储备液 40 微升。然后在第三列和第五列中加入 20 微升溶剂，在第四列中加入 40 微升溶剂。

从第二列的孔中取出 12 微升，加入到第三列的孔中，并混匀。重复此操作，直至获得每个阳性对照化合物的三个剂量组及溶剂对照组的最终系列稀释。为制备阳性对照板，将三个剂量组及溶剂对照组在培养基中进行 1 比 40 的稀释。

为制备化合物主板，将每种测试物质的储备液用培养基重新悬浮并稀释1至10倍，使其浓度为100毫摩尔。使用含10%溶剂的培养基进行稀释，以获得每种测试物质选定的5倍剂量。此时，阳性对照和化合物板均已准备好，可用于向暴露板加样。

接下来，将化合物主板中的5倍浓度溶液各25微升加入细胞中，每组设三个复孔，加样顺序需与化合物主板中的给药顺序保持一致。无需移除现有的细胞培养基。然后，将阳性对照板中的5倍浓度溶液各25微升加入底部一排的细胞中，加样顺序需与阳性对照板中的给药顺序保持一致。

按照文本方案中的说明，准备足量的活细胞染色液。然后，根据供应商的说明，将线粒体染料和膜通透性染料分别用活细胞染色液稀释。向指定用于细胞毒性检测的每孔板中加入 50 微升活细胞染色液。

不要移除细胞培养基，于37摄氏度、5% CO2条件下孵育30分钟。轻轻吸去培养基和染色液，每孔加入100微升固定液。然后，将培养板在室温下避光孵育20分钟。

孵育后，轻轻吸去固定液，每孔加入100 µL洗涤缓冲液洗涤一次。移除洗涤缓冲液后，每孔加入100 µL 1×透化缓冲液，室温避光孵育10分钟。吸去透化缓冲液，再用洗涤缓冲液每孔100 µL洗涤两次。

然后，吸去洗涤缓冲液，每孔加入 100 µL 1× 封闭缓冲液。室温下避光孵育 15 分钟。用一抗溶液将抗细胞色素 C 抗体按 1:250 比例稀释。

接下来，吸除封闭缓冲液，每孔加入 50 µL 一抗溶液，于室温避光孵育 60 分钟。将抗小鼠二抗按 1:500 比例用二抗与核染溶液稀释。同时，将核染料按 1:1,000 比例用二抗与核染溶液稀释。

吸去一抗溶液后，使用板洗机用洗涤缓冲液每孔100微升洗涤3次。吸去洗涤缓冲液，然后每孔加入50微升二抗和核染溶液。将板在室温下避光孵育60分钟。

吸取二抗和核染溶液后，使用板洗机，每孔加入100 µL洗涤缓冲液，洗涤3次。然后，每孔再加入100 µL洗涤缓冲液。此时，该板已准备好在HCS仪器上进行检测，并可启动数据采集。

展示了测试物质处理后的代表性RTCA细胞活力结果。仅在暴露24小时后，1-萘胺、砷、铬和巴豆醛表现出剂量依赖性的毒性效应，它们的计算LD50均低于20毫摩尔。其他化合物未产生毒性效应。

此处展示的仅为1-氨基萘处理的代表性高内涵筛选（HCS）结果。1-氨基萘的毒性效应是诱导细胞膜发生严重损伤，导致细胞膜通透性在暴露四小时后呈剂量依赖性增加。该化合物还会影响线粒体，在暴露四小时后引起线粒体数量增加，并伴随细胞色素C的释放，后者在暴露四小时和24小时后可在细胞核中检测到。

一旦掌握，该技术可在两到三天内完成，因为大多数步骤每天仅需约一小时的动手操作时间用于设置和给药。根据所选方案的不同，高内涵筛选的整个染色程序最多需要三又二分之一小时即可完成。在进行该操作时需注意，尽管选择更广泛的检测终点会增加工作流程的复杂性，但并不会显著延长所需时间。

通过优化的工作流程，实际上可同时对多块培养板进行评估。高内涵筛选平台的持续开发，包括细胞接种、化合物稀释、给药和染色的全自动化，以及新增检测终点的引入，将进一步提升该平台作为毒理学特征分析强大工具的能力。此外，在如此高通量的条件下整合多种单一毒理学检测终点，将推动我们在减少动物化学物质测试方面再向前迈进一步。