基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

本实验的总体目标是描述两种基于人胚胎干细胞和转录组研究的体外发育毒性检测系统。首先，在小鼠胚胎成纤维细胞上培养人胚胎干细胞。第二步是使人胚胎干细胞形成拟胚体，从而生成三个胚层的所有细胞类型，或将其分化为神经外胚层前体细胞。

接下来，在分化过程中，将类胚体或神经外胚层前体细胞用不同浓度的待测化合物进行处理。最后步骤是评估细胞的活力并分离RNA。最终通过转录组微阵列分析，比较经待测化合物处理的细胞与未处理对照细胞之间的RNA表达变化。基于人神经干细胞和DNA宏阵列，我们已建立一种体外方法，可用于监测与人类相关的发育毒性效应。

该方法可由制药和化学工业用于潜在药物及环境毒物的安全性筛选。此方法有助于回答发育毒性领域中的关键问题，例如化学物质对早期神经发育的影响。首先，在室温下解冻干细胞培养基添加剂，并将100毫升该添加剂加入400毫升基础干细胞培养基中。

接下来，将基底膜基质置于冰上解冻，然后按照制造商的建议，将补充体积的基质加入24毫升预冷的DMEM/F12基础培养基中，通过轻轻吹打混匀制成溶液，再将2毫升该混合液分别加入12个独立的6厘米培养皿中。在基质包被培养皿期间，于室温下孵育1小时。

然后吸去培养基，并加入两毫升干细胞培养基。接着，从培养箱中取出四块已长满的人胚胎干细胞 H9 细胞培养板，这些细胞是在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的，饲养层的制备方法见文中配套的实验方案；在体视显微镜下，使用一毫升移液器吸头去除培养板上的分化克隆。

未分化的克隆具有清晰的边界，细胞紧凑；而分化的细胞则开始从边界向外扩散，且细胞体积较大。吸除培养基，用四毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。然后在体视显微镜下加入两毫升干细胞培养基。

用26号针头将菌落切成六至九块，并用1毫升移液器吸头刮取菌团。将切碎的菌落轻柔收集至50毫升离心管中，在200 ×g离心5分钟以形成沉淀。随后，吸除上清液，并将细胞重悬于12毫升干细胞培养基中。

取20微升细胞悬液置于玻片上，在显微镜下计数团块数量。将悬液浓度调整至每毫升含150个团块，然后向每个6厘米培养皿中加入2毫升该悬液。前后左右轻轻晃动培养皿以使细胞均匀分布，随后将培养皿置于细胞培养箱中，每隔一天培养一次。

小心更换培养基。去除分化集落之后，向 Vbo 96 孔板的每孔中加入 40 微升无菌的 5% 嵌段共聚物溶液，在室温下孵育 45 分钟。从培养箱中取出长满集落的融合培养板，在体视显微镜下用 1 毫升移液枪头挑除任何已分化的集落。然后吸除培养板中的培养基，并用 4 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞。

接下来，向每块培养板中加入 2 毫升随机分化培养基。使用传代工具将 H nine 细胞集落切割成大小均一的团块。用细胞刮棒轻轻刮取这些团块，并将其小心收集至 50 毫升离心管中。

在200 ×g条件下离心5分钟使菌落聚集成团，然后吸除上清液，将细胞重悬于随机分化培养基中，调整浓度为每毫升含1000个细胞团。接下来，用多通道移液器将100 µL细胞悬液加入V型底96孔板的各孔中，并在4°C、400 ×g条件下离心4分钟，使细胞团聚集于V型孔底部。随后，将96孔板置于培养箱中培养4天。使用孔径较大的200 µL吸头将类胚体从96孔板中转移至无菌的122毫米方形培养皿中。

接下来，使用一支10毫升无菌刻度吸管将方盘中的胚胎团块转移至15毫升离心管中。静置2分钟使胚胎团块沉降，然后吸除上清液，并用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤胚胎团块。再次静置2分钟使胚胎团块沉降，随后吸除上清液。

将胚胎体重新悬浮于5毫升随机分化培养基中。随后，将胚胎体转移至10厘米的细菌培养皿中，并额外加入10毫升随机分化培养基。将培养皿置于37摄氏度、5% CO2条件下，在水平摇床上孵育。

在50 RPM的转速下，分别显示第5天、第9天和第14天的代表性类胚体。每隔一天小心更换培养基，将全部15毫升替换为新鲜的随机分化培养基。如需评估药物对分化的影响，可根据随附的文字版实验方案，在第5天开始向培养基中添加药物，持续10天。

使用无菌移液管将10厘米培养皿中的胚胎体收集到15毫升离心管中。静置2分钟，然后吸除上清液。用5毫升PBS洗涤，并转移至无核酸酶的1.5毫升离心管中。

静置使其沉淀，然后吸除上清液。将胚胎体悬浮于1毫升三氯试剂中，使用1毫升注射器连接24号针头，反复吹打溶液约15次，以充分裂解细胞。随后，向每个样品中加入200微升氯仿。

短暂涡旋混匀内容物，然后在4°C条件下以12,000 G离心样品15分钟，小心收集上清液至1.5毫升离心管中，避免扰动其他任何层。随后向上清液中加入等体积预冷的70%乙醇，并通过轻轻振荡温和混匀。将700微升混合液转移至微型离心柱中，并按照制造商说明书进行操作，在最终洗脱步骤中纯化RNA。

向离心柱中加入22微升无核酸酶水，在12,000 G条件下离心1分钟。然后移除收集管，将RNA置于冰上。每25 cm²长满H九细胞的培养瓶中加入1毫升预热的消化液，于37摄氏度孵育9分钟。

然后向已处理的细胞中加入2 mL预热的洗涤培养基，用5 mL移液管轻轻吹打5次。将细胞悬液转移至Falcon管中。

接着，用9毫升洗涤液洗涤培养瓶，并将洗涤液加入含有细胞的离心管中。在500 × g条件下离心3.5分钟收集细胞。然后弃去上清液，将细胞重悬于10毫升洗涤液中。再次在500 × g条件下离心3.5分钟，弃去上清液后将细胞重悬于4毫升人胚胎干细胞培养基中。取0.5毫升细胞悬液与4.5毫升新鲜培养基混合，加入至一个预先用PBS洗涤过的、含有经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞的新T25培养瓶中。

每天更换烧瓶中的培养基。用 PBS 中的 0.1% 明胶对 10 厘米培养皿进行包被，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。随后，通过移除培养基收获人胚胎干细胞，并在细胞脱落时向 T25 烧瓶中加入 1 毫升 acuta。

向330微升冷冻基底膜基质中加入6.6毫升冷培养基。将溶液通过40微米细胞筛过滤，并用1毫升过滤后的溶液覆盖六孔板的每个孔。在人胚胎细胞与Accutane孵育30分钟后，将细胞接种至包被好的培养板中，并通过加入1.5毫升Hess培养基终止反应。

用移液管从培养瓶中刮下细胞，然后加入额外的8 mL Hess培养基。使用10 mL移液管轻轻吹打，制成单细胞悬液，经40 µm细胞滤筛过滤后，在500 ×g条件下离心3分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10 mL培养基中，再次于500 ×g离心3分钟。然后弃去上清液，将细胞重悬于10 mL含有ROCK抑制剂Y-27632（终浓度为10 µmol/L）的Hess S培养基中。

接下来，从包被了明胶的培养皿中移除上清液，并将细胞悬液转移至包被了明胶的培养皿中，在37摄氏度下准确孵育一小时。在此步骤期间，滋养层细胞将沉降到明胶包被的培养板上，而人胚胎干细胞则保持游离状态。孵育时间至关重要：孵育时间过长会导致干细胞聚集成团，而孵育时间过短则仅能去除少量这些成纤维细胞，尤其是在成纤维细胞已贴壁的情况下。

用培养板中的培养基轻轻冲洗，使未贴壁的干细胞脱离培养板。再用 10 毫升 Hess 培养基洗涤培养板一次，收集细胞并合并，以 500 ×g 离心 3 分钟，弃去上清液 S，将细胞重悬于约 4 毫升含 10 微摩尔 ROCK 抑制剂 Y-27632 和 10 纳克/毫升成纤维细胞生长因子 2 的条件培养基中。接着，将细胞与台盼蓝混合，在血细胞计数板中进行计数。

基底膜前，每平方厘米接种18,000个细胞。使用包被基底膜的培养板，每孔加入1.5毫升培养基覆盖细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。24小时后更换新鲜培养基；再过24小时后，更换为仅添加10纳克/毫升成纤维细胞生长因子2的新鲜条件培养基，继续培养72小时。

接种细胞后，将培养基更换为无血清替代培养基。此时间点称为分化第0天。在接下来的三天中，每天用新鲜培养基更换一次。

在第四天和第五天更换培养基时，加入由25% N2添加物补充培养基和75% knockout血清替代物组成的混合液。第六天更换培养基后收获细胞用于分析。这些胚状体可用于多种不同的研究。

这是一项示例性细胞毒性研究，展示了不同浓度的甲基汞对细胞活力的影响。根据该图可知，24 微摩尔浓度导致 10% 的细胞死亡，而暴露 14 天后，1.61 微摩尔浓度导致 50% 的细胞死亡。从三个甲基汞处理组的胚胎体中分离出的 RNA 被用于微阵列分析，以检测多种生物标志物。

暴露于0.25微摩尔汞的样本以红色显示，暴露于1微摩尔甲基汞的样本以蓝色显示，对照RNA以绿色显示。该主成分分析图显示，各处理组之间的遗传特征存在显著差异；在暴露于1微摩尔浓度的甲基汞时，超过276个基因的表达水平发生了两倍以上的改变。

在25微摩尔浓度组中，这30个基因也发生了修饰。从该热图可以看出，在1微摩尔处理组中，有233个被修饰的基因表现为表达下调，仅有43个基因表现为表达上调。请注意，操作三唑类化合物或发育中的蚂蚁可能具有极高危险性，因此在进行本实验时，必须采取防护措施，例如佩戴防溅护目镜、耐化学腐蚀的手套，并在通风橱内完成所有与三唑相关的操作。

按照此方案操作后，还可进行其他方法，如染色、铁死亡形成等，这些方法可能会与你的管形成实验相结合，以回答其他问题，例如表型锚定。