基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

本实验的总体目标是构建经嵌合抗原受体修饰的人源化小鼠。该方法有助于回答艾滋病与免疫学领域中的关键问题，例如评估基于干细胞的工程化免疫系统在抵抗HIV感染及其他慢性感染和恶性肿瘤方面的有效性，以及探究免疫系统功能衰竭的机制，寻找增强免疫系统功能的方法，并开发能够产生更强抗病毒或抗肿瘤免疫应答的治疗策略。

该技术的主要优势在于能够进行大量实验操作。人源化BLT小鼠模型模拟了人类免疫系统，在本案例中可用于针对HIV感染的细胞基因治疗的临床前测试。演示该实验流程的将是Valerie Rezek和Brianna Lam，她们是我实验室的技术人员。

首先，在含有补充RPMI培养基的培养皿中，使用手术刀将胸腺切成约1立方毫米大小的小块。然后用弯头钝性镊子将每一块胸腺组织分别放入96孔板的单个孔中。向所有孔中加入100–200 µL培养基，以防止组织干燥。

在显微镜下观察组织，剔除任何可能非胸腺的组织或带有结缔组织的部分。随后，将确认的胸腺组织块转移至T25细胞培养瓶中，加入7 mL含抗生素的RPMI培养基，轻轻摇动以混匀。

然后将烧瓶放入组织培养孵育箱中。此步骤可防止组织受到细菌污染。使用两把解剖刀，在含有IMDM的培养皿中将胎儿肝脏切成约3 mm³的小块，以开始从胎儿肝脏中分离CD34阳性造血干细胞。

去除并丢弃所有白色结缔组织。然后使用配有16号钝头针头的10毫升注射器吸取肝组织块及培养基，转移至50毫升锥形管中。轻柔吹打5到7次，以充分匀浆组织。

配制10毫升IMDM培养基后，加入胶原酶、透明质酸酶、抗生素、DNase和抗真菌剂。将培养基通过0.22微米滤器过滤。然后将过滤后的培养基加入肝组织悬液中。

将含有肝细胞悬液的50毫升锥形管盖紧，并用自封膜（如帕拉膜）密封，以防泄漏。在37摄氏度的培养箱中，使用管式旋转仪旋转孵育90分钟。孵育结束后，将消化后的细胞悬液通过100微米细胞滤网过滤至一个新的50毫升离心管中。

加入 PBS 至悬浮液中，使总体积达到 50 毫升。将悬液分装至两个 50 毫升离心管中，每管含 25 毫升细胞悬液。缓慢且轻柔地沿管壁在每管细胞悬液下层加入 10 毫升密度梯度离心介质，例如 Ficoll。

在1200 × g条件下离心20分钟，中途不得停止。离心后，小心吸取各管中的界面层，并将其转移至两个独立的50毫升离心管中。用PBS将每管界面层的体积补至50毫升。

然后在300 × g离心7到10分钟。用含有2% FBS的50毫升PBS将细胞沉淀合并并洗涤三次，每次在300 × g离心7到10分钟。最后一次离心后，将沉淀重悬于50毫升含10% FBS的RPMI培养基中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数。接着，根据制造商提供的说明书，立即使用 CD34 分选试剂盒分选 CD34 阳性细胞，并分别保存 CD34 阳性与 CD34 阴性组分。将培养瓶中的胸腺组织块和培养基倒入 60 毫米培养皿中。

将一些正向置换移液器吸头放入装有冰的开放1.5毫升无菌螺口管中进行预冷。同时，将细胞沉淀和一定体积的凝胶状蛋白质混合物（如Matrigel）置于冰上。根据批准的动物实验方案，使用注射用麻醉剂对受体小鼠进行麻醉。

通过轻捏小鼠足掌检查其麻醉水平。若小鼠对捏压无反应，则表明已达到手术麻醉深度。将每只小鼠从肩部至髋部的左侧区域（背部中线至腹部之间）进行剃毛。

将稀释后的卡洛芬按每公斤体重6毫克的剂量，皮下注射至动物的肩部或腹股沟三角区域。用PBS冲洗套管针的套管，冲洗液置于60毫米培养皿中。使用一对钝头弯镊，将一块来自60毫米培养皿的胸腺组织置于套管开口内侧，然后回拉套管针，将组织吸入套管内。

接下来，使用正向置换移液器和预冷的吸头，向含有细胞沉淀的离心管中加入五微升（5 µL）冰冷的凝胶状蛋白混合物。轻轻搅拌以制备细胞悬液。将细胞悬液移入套管的开口中，并缓慢回拉穿刺针，使细胞悬液进入针头内。

用聚维酮碘和异丙醇对小鼠的剃毛区域各擦拭三次。在皮肤下确定颜色最深的部位，该部位即为脾脏的位置。肾脏位于脾脏背侧约五毫米处。

通过观察足部捏夹无反应确认麻醉程度适宜后，使用弯头镊提起皮肤，并用手术剪在皮肤上平行于脾脏做一15毫米切口。随后，在下方腹膜层做类似切口。在雄性动物中，肾脏易于观察，仅需按压腹部即可使其自然外露。

用止血钳或一对弯头钝头镊子支撑肾脏。在雌性个体中，卵巢往往阻碍肾脏的顺利取出。使用止血钳夹住卵巢，小心地暴露肾脏。

使用尖头镊子在肾包膜的后端拔出一个微小孔洞。将套管针插入此孔，并沿肾脏滑动，直至套管的开口完全被肾包膜覆盖。轻柔地将套管下的组织推出肾包膜，并将套管缓缓撤出。

使用弯头镊子确保胸腺组织不会随针头带出。接着，用镊子提起腹膜，并用止血钳轻轻将肾脏推回原位。在腹膜处用外科缝线打一个双结缝合。

同时使用两个 Autoclips 伤口夹闭合皮肤。现在将转导的 CD34 阳性细胞混匀，并用胰岛素注射器吸取 100 微升体积中含有 0.5 × 10⁶ 个细胞的悬液。通过眼后静脉注射将这些细胞注入小鼠体内。

注射后，将少量眼用润滑剂涂抹于每只眼睛，然后将小鼠侧卧放回笼中。在完成所有小鼠的植入手术后，确认动物已恢复意识并能够自主活动，方可将其送回饲养室。术后10周处死小鼠，采集血液、脾脏、胸腺和骨髓。

通过流式细胞术对所得细胞进行抗人CD45和抗人CD4抗体染色并进行分析。如图所示，可通过流式细胞术在多种淋巴组织中检测到经CD4嵌合抗原受体修饰的细胞。经CD4嵌合抗原受体修饰的细胞可分化为多种谱系。

本实验中，分离了经CD4嵌合抗原受体修饰小鼠的脾细胞，并对T细胞和B细胞标志物进行染色。T细胞和B细胞标志物呈阴性的细胞，对单核细胞、巨噬细胞以及自然杀伤细胞的标志物呈阳性。来自感染HIV的CD4嵌合抗原受体小鼠的脾细胞，分别用感染HIV或未感染HIV的T细胞刺激，结果显示了其细胞内细胞因子的产生情况。

观看本视频后，您应能够充分理解如何构建经嵌合抗原受体修饰的人源化BLT小鼠。一旦掌握该技术，若操作得当，可在48小时内完成。在进行该操作时，重要的是要保持稳定的操作节奏，并密切注意所操作小鼠的状态。

对于初学者而言，在使用更为珍贵的组织和干细胞之前，练习手术和眼内注射非常重要。该技术建立后，为人源化小鼠模型中研究HIV及其他传染病的疾病发病机制和免疫疗法的研究人员开辟了道路。