皮肤外科去神经术：一种用于检测神经在小鼠皮肤疾病模型中作用需求的方法

本实验的总体目标是研究神经对正常皮肤及病理性皮肤的影响。该方法可用于回答正常皮肤生物学中的关键问题，例如皮肤神经是否影响皮肤的稳态及疾病发生。该技术的主要优势在于，能够对同一动物个体的完整神经支配皮肤与去神经皮肤样本进行直接比较。

对该技术进行可视化演示至关重要，因为神经可能难以辨认，且在尽可能减少对周围组织损伤的情况下进行分离具有挑战性。首先，对小鼠实施麻醉，并通过脚趾夹捏法检查其是否达到适当的镇静水平。同时，确认小鼠呼吸和心跳正常。

现在将动物置于无菌手术区域的加热垫上。使用电动剪毛器，小心地去除将要取活检的背部区域的毛发。然后用碘伏和酒精擦拭棉球擦拭脱毛区域。

确保清除该区域的所有毛发碎屑。现在使用黑色标记笔标出活检区域。为了获得毛囊的纵切面，活检切口的长边应平行于背侧中线，从前向后方向进行。

使用手术刀进行全层切除，避免损伤下方的肌筋膜。通常出血量极少。活检样本应包含表皮、真皮、皮下脂肪和肉膜层（panniculus carnosus）。

将切除的皮肤样本展平于干燥的纸巾上，真皮面朝下。修剪掉多余的纸巾，若需采集其他样本，可将该样本置于冷TBS中保存不超过一小时。返回小鼠身上，使用6-0尼龙缝线，每间隔约三毫米缝合一次，关闭活检部位。

然后将小鼠置于恢复笼中进行监测，直至其恢复意识。根据指定的机构动物护理规范使用镇痛剂，若小鼠出现痛苦迹象，应遵循相关指南进行处理。术后7至10天内拆除缝线。

继续对活检样本进行组织学或全片染色处理。将动物麻醉后，剃除整个背部皮肤的毛发，并参照活检操作步骤清洁该区域。随后使用无菌手术刀从颈部基部沿背部中线切开，直至尾部上方约半厘米处。

使用无菌钝头镊子，轻轻将左侧体侧的皮肤从肩胛脂肪垫靠近颈部处至后肢上方区域向一侧牵拉，以暴露下方组织。在解剖显微镜下辨认背侧皮神经。该神经呈白色条索状结构，沿躯干壁半透明的筋膜向尾侧走行，随后出现明显弯曲，进入皮肤下方的疏松结缔组织。

接下来，使用超细镊子，从动物左侧位于解剖位置 T3 至 T12 的区域中仅分离出神经，将其从神经节段在体壁弯曲处至其进入皮肤的部位拔除。将镊子垂直定向，在神经弯曲点下方约半厘米处夹住神经。一旦夹住，向上牵拉，使神经拉伸并从周围组织中分离，从而将其移除。

避免损伤邻近的血管。在整个操作过程中，需定期滴加0.9%生理盐水以保持组织湿润。继续清除从躯干壁延伸至皮肤的所有神经，但不要破坏躯干壁致密筋膜内的神经。

接下来，去除暴露的皮瓣中的任何神经。这些纤维为背侧皮神经的远端分支，呈白色分枝状细丝，零星分布于皮瓣真皮侧的结缔组织中。去除这些细小分支时，应将镊子大致平行于真皮表面放置，夹住神经后向上拔除。

以这种方式去除所有可见的神经。切勿刺破血管和皮肤。在此步骤中，重要的是避免损伤邻近的血管。

如果发现神经附近有伴行的血管，应沿着神经追踪至无邻近血管的区域，然后通过拔除的方式将其去除。现在，松解背侧正中切口右侧的皮肤，但不要去除任何神经。这将作为对侧假手术对照。

最后，缝合动物，并像之前一样进行术后监测。术后数周，为确认神经去支配的稳定性，用无菌皮下注射针轻轻刺击去神经区域。观察动物是否出现反应，通常表现为颤抖或转头。

如果皮肤区域已稳定去神经化，动物将表现出极轻微或无反应。从无反应区域及其对侧假手术侧采集皮肤活检样本，以获得配对的实验组和对照组样本。在活检样本中，重要的是要取多个组织学切片，以识别假手术组与去神经化样本之间在触觉小体数量或形态上的潜在差异。

glebe one cree ERT2 小鼠品系可将他莫昔芬诱导的基因重组靶向至皮肤中 Hedgehog 信号通路活性较高的区域，例如触觉圆顶上皮。这些小鼠与 abolaxi 报告小鼠杂交，以实现对触觉圆顶上皮的可视化。淋巴结对于维持正常的触觉圆顶结构及其相关的 Merkel 细胞至关重要。

通过实验可观察到，去神经处理后，正常触觉圆顶结构逐渐丧失，同时角蛋白8沉积细胞也随之减少。神经对于促进触觉圆顶中的Hedgehog信号通路也至关重要，这一点可通过Glebe1-CreER2表达以及假手术组和去神经皮肤组织的免疫荧光共聚焦染色（home-mount beta-catenin staining）进行监测。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过手术切除背侧皮神经，以检测这些神经是否参与正常皮肤功能或是否对皮肤疾病具有调节作用。

一旦掌握，该技术可常规且可靠地实施，对动物造成的应激极小。在完成该操作后，可采用氨基荧光染色等方法来确认皮肤中的神经是否已被完全消融，以及基因表达是否受到影响。