从沿海沉积物中同步提取DNA和RNA以及通过实时PCR定量16S rRNA基因与转录本

本实验的总体目标是从近海海洋沉积物中提取高产量和高质量的DNA和RNA，并随后对16S核糖体RNA基因及其转录本进行定量。该方法描述了从海洋沉积物中提取DNA和RNA并进行定量PCR分析的步骤，是环境中微生物丰度与多样性分子分析的关键环节。该技术的主要优势在于，可从同一样本中同时提取DNA和RNA，进而用于定量PCR等下游分析。

演示该实验步骤的是来自高威大学的恩里科·塔蒂博士（Dr. Enrico Tatti）以及来自埃塞克斯大学的博士生邓肯·斯威尼（Duncan Sweeney）。在按照文本方案完成无RNA材料的准备并采集海岸沉积物样品后，取0.5克沉积物转移至2毫升珠磨裂解管中。向管中加入500 µL CTAB磷酸盐缓冲液和500 µL 苯酚:氯仿:异戊醇，颠倒混匀5至10次，使样品充分均质化。

在16,000 × g、4 °C条件下离心10分钟前，先以最高速度涡旋振荡2.5分钟。然后，在通风橱中吸取上层水相，转移至新的无菌1.5 mL微量离心管中。接着将样品置于冰上，并加入500 µL预冷的氯仿:异戊醇（chloroform:isoamyl alcohol）。

然后反复倒置离心管数次，直至出现乳状液，并按之前方法进行离心。在通风橱中，吸取上层水相并转移至新的无菌1.5毫升离心管中。随后，为沉淀核酸，加入两倍体积的30% PEG氯化钠溶液，充分混匀。

将样品置于冰上孵育两小时，或在4°C下过夜孵育。孵育结束后，在4°C条件下以16,000 × g离心20分钟。使用移液器小心移除上清液，注意勿扰动沉淀物。

在离心管中保留约10微升PEG溶液，加入1毫升预冷的70%乙醇。样品离心后，使用微量移液器缓慢吸出乙醇，注意不要触碰沉淀。然后以5秒短离心，去除残留乙醇。

将沉淀在空气中干燥5分钟，然后用50微升经DEPC处理的水重新悬浮。分装15微升用于DNA检测，30微升用于RNA检测。最关键的步骤是在去除上清液时确保DNA/RNA沉淀不被移位，并且在用水平重新悬浮沉淀前确保无残留乙醇，因为乙醇会抑制后续分子反应。

为了消化RNA样品中的DNA，在30微升核酸等分试样中加入3微升DNase I缓冲液和1.5微升DNase I。在37摄氏度孵育30分钟。通过涡旋振荡30秒使DNase失活试剂充分混匀。

然后向样品中加入 4.8 µL 溶液，在室温下孵育 5 分钟，期间偶尔轻弹管底以混匀溶液。离心样品后，小心将含有 RNA 的上清液转移至新管中，注意不要转移沉淀物。为检测 RNA 质量，取 2 µL RNA 加入 18 µL 无菌无 RNase 的去离子水，进行 1:10 稀释。

在不同的PCR反应中，向无菌的0.5毫升PCR管中加入1微升未经稀释或1:10稀释的RNA。根据文本方案中的表格，加入PCR反应组分以扩增16S核糖体RNA基因。需包括阳性对照、PCR抑制剂对照和阴性对照。

然后使用以下扩增参数进行PCR反应。为从RNA生成第一链cDNA，按照文本方案将反应试剂加入0.2毫升PCR管中。将样品在65摄氏度孵育5分钟。

然后将样品置于冰上至少一分钟，再于 25 摄氏度孵育 10 分钟。孵育结束后，按照文本方案中列出的表格添加试剂，并于 55 摄氏度孵育 50 分钟。随后在 72 摄氏度下灭活反应 10 分钟。

根据文本方案制备qPCR用的DNA和RNA标准品后，将环境DNA、cDNA样品、标准品及qPCR试剂在冰上解冻。对核酸标准品进行稀释，并将环境DNA和cDNA从原液至10⁻³进行10倍梯度稀释。为总反应数加上10%的数量配制总反应混合液（master mix），并充分混匀。

在96孔光学qPCR板的每个孔中，加入19微升主混合液和1微升模板，每个样本设三个重复。使用qPCR光学封膜覆盖板子。然后将板子短暂离心，并放入qPCR仪的加热模块中。

接下来，打开qPCR管理软件，然后点击“方案”选项卡，点击“新建”，并添加以下扩增条件。将样品体积设为20 µL，点击“确定”，并保存该方案。现在选择“板”选项卡。

然后，在“编辑所选”下点击“选择荧光染料”。为相应的探针添加报告荧光染料，然后点击“确定”。选中包含标准品的孔，接着从“样本类型”菜单中选择“标准品”。选择“重复系列”以将重复数量更改为三个，然后点击“应用”。

选择稀释系列以添加标准品一的计算起始浓度。指定稀释倍数为10，根据标准曲线加入板孔的顺序选择递减或递增，然后点击应用。选中包含未知样品的孔位，并在样品类型下拉菜单中选择未知样品。

选择重复系列并将重复次数更改为三，然后点击应用。在样本名称下，编辑样本名称，并对无模板对照孔重复此操作。随后，在板编辑框中点击确定并保存文件。

然后点击“开始运行”。运行完成后，选择“定量”选项卡以显示标准曲线、标准曲线参数以及扩增曲线图。最后，选择“定量数据”选项卡以查看未知样品基因的Cp值及其对应的起始拷贝数。

根据文本方案确定每克湿重沉积物中的基因拷贝数。如本凝胶图像所示，成功的核酸提取会产生清晰的 DNA 和 RNA 条带，除可见高分子量的基因组 DNA 条带外，还可见清晰的 23S 和 16S 核糖体 RNA 条带。该图显示，当正确配制十倍系列稀释液并进行扩增以生成用于 qPCR 反应的标准曲线时，每个标准稀释液之间的循环数差异为 3.3 个循环。

如果存在无模板对照（NTC），则必须报告其扩增曲线的交叉点（Cp值）。若出现此情况，应根据先前所述方法，将标准品和未知样品的Cp值 cutoff 设定为比NTC的Cp值高3.3个循环或一个对数倍数。本实验中，对环境样本的原液、10⁻¹、10⁻² 和 10⁻³ 稀释液进行了扩增。

纯样品未扩增，10的负一次方至10的负三次方稀释度的Cp值分别为24.12、26.02和28.40。如本图所示，理想的标准曲线参数包括R²值为0.99，PCR扩增效率在90%至110%之间。本实验中，NTC的Cp值为30.5，并设定阴性Cp阈值为27.2。

将基因丰度转换为每克湿重沉积物中的数值后，10⁻¹和10⁻²稀释度的结果分别为2.5 × 10⁷和7.1 × 10⁷。10⁻³稀释度的Cp值高于NTC阈值。在此情况下，选择10⁻²作为最佳模板稀释度。

在进行该实验操作时，需牢记RNA极易降解，因此必须始终将样品置于冰上，并佩戴手套以避免RNase污染。切勿忘记，本实验涉及苯酚：氯仿和异戊醇，这些试剂具有极高危险性。操作过程中应始终采取预防措施，例如穿戴实验服、手套和护目镜，并在通风橱内进行操作。

观看本视频后，您应能充分理解如何从海洋近海沉积物中提取 DNA 和 RNA，并定量分析基因及转录本的丰度。请记住，该方法可轻松用于从大多数环境样品（包括土壤）中提取 DNA 和 RNA，并定量多种基因靶标。