环境DNA应用中物种特异性定量PCR检测方法的开发与验证

经过良好优化的检测方法对于正确解读环境DNA数据至关重要。本方案描述了开发此类检测方法所需的设计和测试步骤。通常，环境DNA是一种用于检测特定物种或一组物种的非侵入性方法。

与传统调查方法相比，该方法可能降低成本且具有更高的灵敏度。通过检测目标物种的DNA，该方法有助于保护工作和野生动物管理，从而可推断该物种在采样区域的存在。由于定量PCR具有极高的灵敏度，容易发生污染，因此需要设置阴性对照，以识别污染引入的步骤。

eDNA 是一个充满专业术语和缩写词的领域。对于不熟悉分子生物学或定量 PCR 的研究人员而言，通过可视化演示有助于从概念构思到数据生成的实验设计规划。本次实验操作将由本实验室的生物学家 Dannise Ruiz Ramos 和学生实验助手 Trudi Frost 进行示范。

首先，使用 NCBI 核苷酸数据库搜索并下载目标物种多个基因区域的序列。选择所有符合要求的序列，然后点击“发送至”。选择“完整记录”，目标为“文件”，下载格式选择 GenBank 或 FASTA，然后点击“创建文件”。这些序列现已保存至计算机中。

对所有目标物种重复上述步骤。将每个基因区域的序列保存在单独的文件中，因为它们将被分别分析。为了分别比对每个基因区域的序列，请将下载的序列文件导入序列比对软件，例如 Geneious Prime 软件。

为每个基因区域创建单独的文件夹，然后选择包含一个基因区域序列的文件夹中的所有序列。使用多序列比对工具（如 Geneious 或 MUSCLE）对选定的序列进行核苷酸序列比对。通过可视化比对后的序列数据，筛选出适合引物探针设计的候选区域。

选择一个针对目标物种具有大量序列数据可用、在不同物种间高度分化且种内变异较低的区域。接下来，设计检测的引物和探针。使用 qPCR 检测设计软件设计五组 qPCR 检测体系。

将选定的序列粘贴到“序列输入”框中。如果比对产生了空格，请从序列中删除这些空格。在“选择您的设计”选项中选择qPCR 2引物探针，然后下载推荐的引物探针组合。

复制第一个检测的正向引物序列，并在先前创建的比对结果中搜索该引物序列。如果使用 Geneious Prime，可使用“Annotate Predict”工具将引物区域添加到比对结果中。对所有引物和探针组合均执行此操作。

检查目标物种以及共存物种在比对中的这些区域是否存在变异。通过 NCBI 的 Primer-BLAST 对引物进行计算机模拟测试。将引物粘贴至“引物参数”下的“使用我自己的引物”框中。

在引物对特异性检测参数选项中，选择 NR 作为数据库，并在“生物体”框中输入目标生物的分类目或科。确保所选引物不太可能扩增非靶标物种。通过生成标准曲线，在体外检测检测方法的扩增效率，并确定该曲线的效率和线性范围。

使用含有目标序列的合成DNA标准品，至少检测六个十倍稀释梯度，每个反应中的拷贝数约为1至100万拷贝。利用qPCR软件将每个标准品的CQ值绘制在Y轴上，将每反应拷贝数的初始标准浓度的以10为底的对数绘制在X轴上。qPCR软件应自动进行线性回归分析。

根据回归曲线的斜率计算扩增效率。通过扩增效率和R²值评估标准曲线是否存在偏差或性能不佳的情况，并进行目视检查。使用内部阳性对照检测实际田间样本是否存在PCR抑制，因为PCR抑制可能导致检测灵敏度降低和假阴性结果。

确定每种检测方法的检出限和定量限。使用非靶标物种测试检测方法以验证其特异性，并确保检测方法在与内参质控（IPC）进行多重检测时表现良好。具有高灵敏度、特异性和扩增效率的检测方法可进入后续步骤。

为了进行该检测方法的原位测试，需采集多个水样并进行qPCR处理。运行定量PCR检测，将eDNA浓度和检出频率与已知物种分布和丰度的位点差异进行比较。通过测序确认所有检出结果。

下载并比对了Clinch河中所有蚌科（Unionidae）物种的可获得序列。在设计了多条引物后，将五组引物和探针添加至比对结果中进行可视化评估。这些引物和探针组合在计算机模拟（in silico）和体外实验（in vitro）中进行了测试。

在实验室中，使用27种可获得物种的DNA提取物对所有检测方法进行了测试，以验证其特异性。其中一种检测方法仅成功扩增了目标物种。此处展示了一种具有高效扩增能力和良好R平方值的成功检测方法。

所选检测方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）均为每反应5个拷贝。相比之下，标准曲线扩增效率较差的检测方法则被舍弃。在高质量的qPCR中，标准品系列稀释样本的扩增应在每个浓度十倍差异时，其循环定量值（Cq）间隔约3.3个循环，呈均匀分布。

在较差的 qPCR 实验中，标准品在不同稀释度之间的循环定量值可能出现不均匀的变异。未知样品的内参扩增结果应与阴性模板对照的内参扩增结果进行比较。如果样品中不存在抑制物，则所有内参扩增在图中应呈现紧密聚集的趋势，其循环定量值应与无模板对照几乎相同。

为进行现场检测，采样点包括溪流中贻贝群落的底部、近岸处贻贝群落的底部、群落下游100米处的溪流底部、群落下游500米处的溪流底部，以及群落下游500米处的近岸区域。环境DNA的定量PCR检测技术有助于监测入侵物种和濒危物种，同时能够在无需实际捕获个体生物的情况下，增进我们对物种检出在空间和时间上变化规律的理解。