从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞及其细胞表型分析

本实验的主要目标是从小型猪无创采集滑膜液和骨髓，以获取间充质干细胞，用于组织再生和免疫调节研究。该方法有助于解答耳科学间充质干细胞治疗领域中的关键问题，例如如何建立滑膜液来源的间充质干细胞，以及如何将其与骨髓来源的间充质干细胞进行表征比较。该技术的主要优势在于能够有效建立小型猪滑膜液和骨髓来源间充质干细胞的关键特性，为临床应用提供支持。

该技术的应用前景涉及多种关节疾病的治疗，因为在运动员患者中，滑膜腔内滑液来源的间充质干细胞（MSC）数量显著增加。尽管该方法可为再生医学研究提供重要见解，也可应用于其他研究领域，例如自身免疫性疾病的研究。由于小型猪的间充质干细胞具有自体来源特性，其免疫抑制效应可能对人类具有借鉴意义。

除其他科研人员外，本次操作演示将由我实验室三年级的 Hyeon-Jeong Lee 和 Won-Jae Lee 完成。首先，将麻醉后的迷你猪体位调整至便于接触髂嵴的位置。接着，使用剃刀或剪毛器对髂嵴上约 15 平方厘米的区域进行脱毛处理。

然后，用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤三次。待完全干燥后，铺上无菌巾。现在，用3至4毫升肝素溶液冲洗一支10毫升注射器，进行预涂层处理。

这可以防止骨髓在提取过程中凝固。然后，在髂骨嵴处，将骨髓抽取器紧密连接至涂有肝素的注射器上，准确抽取至少五毫升骨髓。为了从提取的骨髓中分离细胞，首先在室温下将骨髓与等体积的DPBS在15毫升锥形管中稀释。

然后，将3毫升密度梯度离心液加入另一支15毫升锥形管中。接着，小心地将4毫升稀释后的骨髓液转移至密度梯度离心液上，形成两层溶液。现在，在室温下以400 ×g离心40分钟。

所需单个核细胞收集于中间白色层中。仅吸取此层。将单个核细胞层排入15毫升锥形管中，并用7至8毫升DPBS稀释。

然后，在室温下以 500 × g 离心细胞 10 分钟。弃去上清液，并用 10 毫升 DPBS 将沉淀的细胞洗涤两次，每次均重复上述离心步骤。两次洗涤后，将单个核细胞（MNCs）重悬于 2 毫升 ADMEM 中。

然后，将细胞接种至35毫米的组织培养皿中，在38.5摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。48小时后，吸除培养基及未贴壁的单个核细胞。随后，重新加入2毫升新鲜ADMEM培养基，继续孵育，并每三天更换一次培养基。

当细胞达到70%至80%融合度时，用新鲜的DPBS洗涤培养物。随后，在37摄氏度下使用1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3至5分钟。用10毫升ADMEM收集细胞，并转移至15毫升锥形管中。

然后，在室温下以 300 ×g 离心 5 分钟沉淀细胞，并弃去上清液。接着，将收集的单个核细胞（MNCs）重悬于 1 毫升新鲜 ADMEM 培养基中，并测定细胞密度。最后，将每毫升含 50 万至 75 万个细胞的悬液接种至 T25 培养瓶中，每瓶加入 4 毫升 ADMEM 培养基。

将培养瓶与培养板同样孵育，并每隔三天更换一次培养基。在股关节处准备一块15×10厘米的皮肤区域，操作方式与采集骨髓时相同。然后，在皮肤下触诊以定位髌骨和胫骨嵴，确定滑膜关节位置，随后用一支3毫升注射器配23号针头，准确刺入关节腔内。

通过轻柔抽吸，抽取0.5至1毫升液体，并立即拔出针头。如果滑膜液量过少，可用DPBS冲洗关节腔，以收集与DPBS混合的滑膜液。DPBS的使用体积需根据滑膜腔的大小进行调整。

健康关节中滑膜液的最佳体积有限，其体积随关节的大小和病理状况而变化。为从滑膜液中分离细胞，需在室温下将滑膜液与等体积的DPBS加入15毫升锥形管中进行稀释。

接下来，通过40微米尼龙细胞滤网过滤稀释液，以去除碎片。然后加入10毫升DPBS，将悬液在室温下以400 × g离心10分钟。随后弃去上清液，并使用DPBS将细胞洗涤两次。

将洗涤后的细胞沉淀重悬于2 mL ADMEM中，然后按照间充质干细胞（MSCs）的培养方法进行细胞培养。间充质干细胞已成功从迷你猪的骨髓和关节滑膜组织中分离，并在体外扩增。

滑膜液来源的间充质干细胞（MSCs）形态与骨髓来源的间充质干细胞相似：两者均呈成纤维细胞样梭形，且均匀贴壁生长。在完成第三次传代培养后，MSCs 显示碱性磷酸酶染色呈阳性表达。接下来，对两种培养物中的表面标志物进行了分析。

与预期一致，两种类型的间充质干细胞均显著表达CD29、CD44和波形蛋白（Vimentin）。相比之下，CD34和CD45的表达呈阴性或低表达。这些结果与通过不同来源的间充质干细胞获得的结果相同，包括从滑膜液中分离的细胞。

观看本视频后，您应能够充分理解如何以非侵入性方式从小型猪中抽吸滑膜液和骨髓，以分离其中的间充质干细胞（MSC），并掌握对该MSC进行比较分析和表型鉴定的方法。在实施该操作时，重要的是要牢记通过仔细触诊准确定位髂嵴和滑膜的目标穿刺点。在完成本操作后，可进一步开展其他研究方法，例如在骨关节炎或类风湿关节炎模型中，探究不仅骨髓来源的MSC，滑膜液来源的MSC是否也具有相同的软骨或成骨启动能力以及免疫抑制功能，从而回答更多相关科学问题。

该技术在开发后，通过帮助表征关节炎患者受累或发炎关节中分离出的间充质干细胞（MSCs），推动了关节疾病自体治疗的发展。