利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

本实验的总体目标是通过两种方法分离、鉴定并诱导分化来自恒牙的人类牙髓干细胞。该过程首先收集健康的阻生智齿，并在牙骨质与釉质交界处进行切割。牙髓多能干细胞（D PSCs）通过两种不同的方法进行分离。

在第一种方法中，多发性息肉组织通过在 I 型胶原酶加椎间盘溶液中孵育进行酶消化。此处我们将其简称为 ed。在第二种方法中，考虑到分离方法，仅将息肉组织直接放入培养瓶中，不进行任何消化处理。

通过这种方式，dpss 开始从组织迁移到培养瓶中。这些细胞被称为 OG，指的是外生长法分离方法。该操作步骤的第二步是使用流式细胞术鉴定干细胞。

该实验流程的第三步是诱导成牙本质细胞分化，最后一步是通过红色染色和QBCR对两组之间的成牙本质细胞分化进行比较评估。我是来自里安研究所干细胞与发育生物学系的RA Kde。今天我将向您展示利用两种方法对人源间充质干细胞进行分离、表征及比较性分化的实验操作。

您好，我是来自里约研究所的Rezaian博士。我们正在开展一项与人牙髓干细胞相关的研究项目。这类细胞属于间充质干细胞，获取过程简便，且疼痛和并发症风险极低。

间充质干细胞具有可塑性潜能、集落形成能力以及多向分化潜能。大家好，我是来自干细胞系的Dr.Ami。在本研究所，我们在实验室中采用此方法分离干细胞，用于科学研究及未来应用。

在再生医学中，将这类干细胞用于未来基于干细胞治疗的第一步，是选择从人体组织中分离干细胞的最佳方案。为实现这一目标，关键在于研究不同干细胞分离条件下细胞行为的某些特定方面。首先，我将通过酶解法消化牙髓组织或利用组织块贴壁法使干细胞从组织植块中迁移生长，来分离人牙髓干细胞。

然后对它们进行表征，并诱导分化为卵原性胚泡。现在让我们开始。首先，将胶原酶I型和细胞按一定间距置于PBS中溶解。

然后使用0.2微米注射器滤器过滤。将滤液收集至锥形管中。随后加入青霉素和PBS，以达到最终浓度。

在低温基础培养基中，于无菌条件下将健康的智齿转移至实验室。研究前用70%乙醇清洁牙齿表面，并确保清除牙齿表面的气流残留。

使用无菌牙科切割片在牙骨质-釉质交界处环切牙齿，以暴露牙髓腔。应注意切割过程必须缓慢进行，以减少牙体组织过热。然后用Scarpa刀片轻轻分离牙冠中的牙髓组织，将牙髓组织切成1至2毫米的小块。

将少量牙髓组织放入1毫升酶溶液中，在37摄氏度下孵育1小时，每30分钟涡旋振荡一次，以帮助分散牙髓组织。随后，通过70微米细胞滤网过滤，去除大的组织团块。然后加入含有PENER的PBS，以1,200转/分钟离心5分钟。

小心移除上清液。然后将平板悬浮于增殖培养基中，转移至培养瓶并加入培养基。随后进行培养。

每三天更换一次培养基，直至细胞达到外植法所需的汇合度。重复切割过程。切割牙齿是指将牙囊组织切成一到两毫米的碎片。

然后将它们放入培养体系中，加入增殖培养基并进行孵育。需要注意的是，增殖培养基的总体积必须足以支持所有组织块的贴附，以利于后续细胞的迁出。

观察到细胞向外生长后更换培养基，之后每三天更换一次，直至细胞达到汇合。进行免疫表型分析时，将两种类型的D PSCs与PE或FITC标记的抗体在4摄氏度避光条件下孵育30分钟。然后加入PBS，在1,200 RPM转速下离心5分钟。

弃去上清液，重悬沉淀，将细胞用 PBS 重悬后，通过流式细胞仪检测表面标志物，并对两种 DPCs 进行连续三传代的亚培养。然后将细胞置于冰上用胰蛋白酶消化，转移至六孔培养皿中，当细胞融合度达到 60% 时，将基础培养基（PM）更换为成牙本质诱导培养基。其中三个孔作为阴性对照，继续添加基础培养基（PM）。

在第21天，每三天更换一次培养基，用PBS洗涤细胞。然后每孔加入1毫升固定液，在室温下用10%甲醛凝胶固定15分钟。

15分钟后，小心去除固定剂，并用蒸馏水洗涤细胞三次。然后将水替换为每孔红色染色液1毫升。20分钟后，去除多余染料，并用去离子水洗涤细胞四次。

然后每孔加入一毫升水，以防止细胞干燥。染色后，在显微镜下观察，与对照组相比，可见三条上轨变为红色；通过高倍镜观察细胞周围红色染料的吸收情况，可用于红色染色的定量分析。去除水后，每孔加入一毫升10%乙酸，随后在摇床上孵育30分钟。

然后使用细胞刮轻轻刮下培养板上的细胞，将其转移至不同的离心管中，剧烈涡旋振荡30秒。

然后在85摄氏度加热10分钟。为避免蒸发，用Parafilm密封管子，转移至冰上冷却5分钟，随后在20,000 ×g离心15分钟。同时，根据试剂盒说明书配制刚果红标准品的系列稀释液。

离心后，移除上清液并将沉淀转移至新管中。用10%氢氧化铵调节pH值至中性。然后将标准品和样品加入96孔板中。

将细胞接种于孔板中，随后在405纳米波长处测定吸光度，并根据标准系列稀释曲线分析数据。在此可见第10、15和18天通过酶解法分离获得的牙乳头细胞（DPCs），以及第5、10、13和18天从组织块长出的DPCs。在情况三中，两种类型的DPCs大小和形态基本一致。免疫表型分析结果显示，细胞表达间充质干细胞标志物，如CD44、CD73和CD9，而不表达造血和内皮细胞标志物，如CD34、CD45和CD11b。有趣的是，与酶解法获得的DPCs（D-P-S-C-E-D）相比，组织块法长出的DPCs中CD105和CD146的表达水平更高。在成牙本质细胞分化第21天时，茜素红染色定量结果显示，与组织块法来源的干细胞相比，酶解法获得的DPCs钙沉积更多。

qPCR结果还表明，与牙源性干细胞相比，D-P-S-C-D中作为矿化标志物的MEP和A LP基因表达显著升高。同时，在分化过程中，这两个基因均受到调控，且作为成牙本质标志物的DSPP基因表达也随分化而增加。然而，在ED组与OG组的分化细胞中，DSVP基因的表达无显著差异。

我们刚刚向您展示了如何通过酶解离牙髓或从组织外植块中生长出干细胞的方法来分离人牙源性干细胞。以上就是全部内容。希望您在实验中成功应用此方法时好运。

谢谢。