从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

本文的总体目标是建立从小鼠成年心脏中分离、鉴定和诱导心脏干细胞（CSCs）的标准化实验方案。该方法有助于回答心血管疾病及区域性治疗领域中的关键问题，例如心脏干细胞治疗和心力衰竭。该技术的主要优势在于成本低廉，并可在较短时间内高效获得大量细胞。

按照方案所述，在无菌条件下准备好本实验所需的所有材料、仪器和分离缓冲液。处死小鼠后，去除其腹部皮肤，在无菌操作台内剪开肋骨以暴露胸腔。暴露心脏后，使用1毫升注射器吸除心脏附近的血液。

为清除心脏附近的血液，用冰冷的PBS冲洗周围区域。使用手术剪和镊子分离心脏，并将其置于含有10毫升冰冷PBS的100毫米培养皿中。用弯柄镊轻轻挤压心脏，以去除心腔内的残留血液。

将四到五个分离的心脏转移至含有10毫升冰冻汉克斯平衡盐溶液的100毫升培养皿中。再次轻轻按压心脏，以冲洗并去除心脏内部残留的血液。为确保彻底清除血液，每次冲洗后均需更换HBSS溶液。

用一对镊子夹住每颗心脏，在含有5至7毫升HBSS的100毫米培养皿中，使用手术刀片将心脏切成2至4毫米大小的组织块。频繁更换溶液以确保彻底去除血液。最后，在HBSS溶液中将心脏组织进一步剪碎。

将置于50毫升锥形管中的剪碎心脏在4摄氏度下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入5至6毫升0.2% II型胶原酶溶液以消化组织。将管子置于摇床上，在37摄氏度、75 × g条件下振荡45至60分钟，充分重悬沉淀。

每20至30分钟，用手剧烈振荡试管以增强裂解效果。使用5毫升血清移液管和1毫升移液枪头吹打裂解后的组织混合物，将组织团块解离成单细胞悬液。为终止组织的酶解反应，加入体积为裂解后组织2至3倍的商用CSC维持培养基。

将消化后的细胞悬液通过置于50毫升锥形管上的100微米细胞筛网，以去除未消化的组织碎片。为了通过密度梯度离心分离细胞，向50毫升锥形管中加入37摄氏度预热的聚蔗糖和泛影酸钠溶液。然后，缓慢而轻柔地将等体积的滤液加在该溶液上方，避免两种溶液混合。

必须将滤液沿管壁缓慢加入到聚蔗糖和泛影酸钠溶液上层，同时将试管倾斜45度，避免混合。切勿将聚蔗糖和泛影酸钠溶液加在滤液上方。将试管极其缓慢地放入水平转子离心机中，确保液体分层不被扰动。

在室温下以500 × g离心20分钟，设置较低的加速度和减速度，以避免两种溶液混合，并实现心脏干细胞的有效分离。必须非常小心地加入梯度溶液，避免对离心管内溶液造成扰动。离心机的加速度和减速度必须设置为最低速度，例如1或0。

使用1毫米移液器将含有CSC的上层絮状层连同过量溶液转移至15毫升无菌管中。加入等体积的CSC维持培养基，并充分混匀，以中和残留的聚蔗糖和泛影酸钠溶液。将此悬液在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。

弃去上清液。用不完全DMEM溶液至少重复洗涤CSCs两次。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟，以去除残留的聚蔗糖和泛影酸钠溶液。

去除上清液后，将含有纯化CSCs的沉淀重悬于1毫升CSC维持培养基中，然后进行细胞计数。将CSCs接种至经含0.5%纤维连接蛋白的0.02%明胶溶液包被的六孔培养板中，每孔加入2毫升完全维持培养基。于37°C、5%CO₂条件下培养细胞。

当CSC培养达到汇合状态时，按照文本方案所述，将细胞转移至新的明胶和纤连蛋白包被的培养板中。将这些传代后的P0代CSC在37摄氏度、5%CO2培养箱中，用完全CSC维持培养基继续培养至汇合。重复将细胞转移至新培养板以获得P1代CSC，可用于后续实验。

为了在初始阶段维持CSC培养，需按照文本方案中所述进一步接种细胞。为表征培养的细胞，将含有CSC的培养板置于荧光显微镜的物镜上。使用10倍放大倍数对细胞进行聚焦。

观察细胞时，使用相差光圈，通过更换物镜将放大倍数调至20倍，然后对CSCs进行成像。完成免疫染色后，将培养板置于荧光显微镜下，以不同放大倍数对细胞进行聚焦，利用相差显微镜和不同的激发滤光片观察细胞，并保存图像。

进行细胞分化时，将CSCs在六孔板中培养，每孔加入2 mL 37摄氏度预热的CSC维持培养基。当细胞融合度达到80%至95%时，弃去维持培养基，更换为2 mL 37摄氏度预热的心肌细胞分化培养基。在37摄氏度、5% CO2条件下培养，持续两到三周。

每两到三天更换一次分化培养基。换液时，在显微镜下观察细胞形态，以确保培养状态良好。培养12天后，按照标准免疫荧光染色方案对细胞进行分化标志物的成像检测。

在相差显微镜下观察，培养2至3天的CSCs呈纺锤形形态。培养7天后，其形态发生变化，变得更为细长。经多能性标志物免疫染色后，CSCs显示表达OCT4、SOX2和Nanog。

此外，心脏干细胞（CSCs）在培养基中增殖，并表达增殖标志物Ki67。为鉴定CSCs的心脏来源特性，检测了心脏标志物的表达，结果显示这些细胞对心脏标志物Sca-1、NKX2.5和GATA4呈阳性。在心肌细胞分化培养基中培养12天后，分化的CSCs表达心肌细胞标志物ACTININ和TROPONIN-I。

进行此操作时，重要的是注意不要让梯度溶液与滤液混合。同时，应将加速度和减速度设置为最低速度。无论何种情况造成污染，均建议在生物安全柜内完成所有细胞分离过程。

采用此方法后，还可进行其他实验技术，如基于磁珠的分离或基于流式细胞术的细胞分选，以回答更多科学问题，例如：心脏干细胞的均一细胞群体纯度如何？心脏干细胞的裂解半径较大，是重要的标志特征，且其特性与心肌细胞存在差异。该技术的建立将为心血管疾病领域的研究者提供重要支持，使其能够从小鼠心脏中高效获取大量心脏干细胞，这在缺血性心力衰竭的再生治疗中可能具有重要意义。

请注意，使用手术刀、漂白剂和二甲基亚砜（DMSO）可能存在危险，在进行本操作时，应始终采取相应防护措施，例如佩戴个人防护装备（PPE）。