核酸过滤分离：一种简单快速的DNA提取方法

该FINA方法（即核酸过滤分离法，Filtration Isolation of Nucleic Acids）的总体目标是通过快速简便的方式从复杂样本中分离基因组DNA，用于PCR扩增，且无需使用离心机等实验室仪器。这种基于纸质材料的快速DNA提取方法专为HIV前病毒DNA检测而开发，可整合至定量PCR诊断装置中。该技术的主要优势在于，样本前处理模块和PCR管可预先制备，因此DNA提取过程耗时不到两分钟。

我们最初开发该方法旨在将其整合到样本中，用于通过足跟采血检测婴儿早期HIV-1感染的诊断。通常，初次接触该方法的研究人员可能会在操作中遇到困难，因为移除双面胶带背面（用于将细胞捕获膜固定在PCR管侧壁）的步骤需要一定练习。本实验操作将由我实验室的高级技术员Jen Reed进行演示。

开始此操作前，需准备用于组装 FINA 样品制备模块所需的材料。通过裁剪一块 35 毫米 × 35 毫米的 2.6 毫米厚 100% 棉垫，制备 blotting 垫。准备带纸背胶带的塑料石蜡膜。

裁剪一块25 mm × 50 mm的石蜡膜，然后使用锤子在膜的中心冲出一个直径为7.14 mm的孔。通过使用锤子冲出一个直径为8.35 mm的圆形，制备一个固定的玻璃血液分离膜或捕获圆盘。组装FINA样本制备模块时，用镊子将捕获圆盘放置在印迹垫的中心。

取下石蜡膜胶带的背衬，将其覆盖在捕获圆盘上，使石蜡胶带完全露出捕获圆盘的中心区域。通过轻微拉伸石蜡胶带以覆盖吸水垫，并用力按压石蜡胶带，使其牢固粘附在圆盘四周的吸水垫上，确保圆盘与吸水垫之间实现最大程度的接触。需要使用直径为5.1 mm的胶带圆片，将捕获膜固定在qPCR管侧壁，以防止膜阻碍实时PCR仪的荧光检测。

使用锤子从双面涂覆的聚酯诊断胶带片材上冲压出圆形胶带片，制备此胶带圆片。用镊子移除胶带贴纸衬垫的一侧。将胶带放入一个 200 微升 PCR 管中，使其粘附在管壁一侧并靠近管底。

移除第二个贴纸衬垫。此时试管已准备好接收制备好的样本圆盘。本视频将演示从加入8e5 LAV细胞的全血中检测前病毒DNA的过程。

将先前冷冻的8e5 LAV细胞沉淀物置于冰上解冻。用冻存液对细胞进行系列稀释，浓度范围为每微升1至400个细胞。从每个稀释液中吸取10微升细胞，加入微量离心管中。

向每支试管中加入 100 微升新鲜的 HIV-1 阴性 EDTA 抗凝全血样本，以建立标准曲线。轻轻弹击试管底部五次，充分混匀。开始 DNA 提取步骤时，通过加入 Triton X-100 至终浓度为 1%，裂解血细胞。

轻轻弹击管底5次以混匀，血液应变为半透明红色。将全部血样用移液器转移至捕获圆盘上。

石蜡胶带与捕获膜之间的密封性可确保血液流经膜。接触膜与吸水垫组件之间的良好接触可确保样本快速毛细渗透。让样本充分浸透滤膜。

血液裂解物已渗入捕获圆盘，圆盘表面呈哑光状。将600至1,000微升10 mmol氢氧化钠逐滴加入捕获圆盘。滤膜颜色将由红色变为白色，表明血红蛋白已被清除。

接下来将滤纸片从印迹垫上分离，并将其贴附到已准备好的PCR管中的胶带上。滤纸片放入PCR管后，应立即分析样品。按照方案文本所述配制qPCR预混液，并确保滤纸片完全被预混液覆盖，且在反应过程中始终固定在管壁上。

按照方案文本所述，使用实时 PCR 仪器进行扩增。或者，如果无法立即进行 qPCR，则将滤膜置于含有硫酸钙干燥剂的盒子中，在室温下干燥过夜。次日，盖紧 PCR 管，放入含硅胶干燥剂的铝箔袋中，于室温保存直至准备分析。

该方法可实现从不同拷贝数的8e5 LAV细胞中高效扩增HIV-1前病毒。实线为HIV-1阴性全血样本中分别添加4,000、400、40和10个8e5 LAV细胞后，进行四次重复实验所获得的扩增曲线，每次反应中内参对照为500拷贝。虚线表示阈值。

下一张图显示了从扩增曲线计算得到的定量循环值（Cq值）与每100微升全血中8e5个LAV细胞的对数拷贝数之间的标准曲线。计算得到的PCR扩增效率为103%。HIV前病毒DNA标准曲线的重复样本也显示出高度可重复的扩增结果。

此外，内参含有500拷贝的羟基丙酮酸还原酶，表明采用该方法提取血液时，无论样本中HIV-1前病毒拷贝数如何，均不会产生PCR抑制。实线代表扩增曲线，虚线代表阈值线。通过该程序，可从多种类型的标本中扩增目标基因，以检测您感兴趣的基因。

例如，用于药物基因组学筛查的口腔拭子，或用于动物模型快速基因分型的血液样本。请务必注意，处理血液传播性病原体可能具有极高危险性，在进行此操作时应始终采取通用防护措施。