脊索动物海鞘 Ciona intestinalis 的胚胎显微注射与电穿孔

瞬时转染技术在海鞘胚胎中的总体目标是研究形成类似蝌蚪幼虫所必需的基因调控和功能，利用其稳定的细胞谱系和紧凑的无脊椎动物基因组，以深入了解脊索动物无脊椎动物的起源。该方法有助于解答分子遗传学领域的一些关键问题，例如与干细胞研究和药物发现相关的脊索动物发育程序的保守机制。该技术的主要优势在于，通过胚胎电穿孔，可在一天内处理数百甚至数千个同步发育的胚胎。

初学者通常会遇到困难，原因在于胚胎去壳过程容易损伤脆弱的胚胎，且难以掌握高效的显微注射技术。首先在18°C的低温胚胎操作室中解剖海鞘成体。使用小剪刀在出水孔的对侧以及较短的出水孔一侧进行剪切，该位置下方分别为输卵管和输精管。

延长切口以暴露输卵管。然后，使用剪刀尖端在输卵管上进行精确剪切。用闭合的剪刀轻轻按压输卵管，并剥离卵子。

将卵子直接落入含有 HEPES 的人工海水的六孔板中。使用预先用 ASWH 冲洗过的巴斯德吸管收集并转移剩余的卵子。采集精子时，用剪刀剪开精管，然后用另一根巴斯德吸管收集浓缩的精子，并转移至 1.5 毫升离心管中。

通过将1毫升ASWH和50微升Tris加入1.5毫升微量离心管中来激活精子。然后加入20微升浓缩精子，盖紧管盖，并通过倒置试管或使用巴斯德吸管轻轻混匀。接着，向每孔卵子中加入100至200微升激活后的精子溶液，并通过上下吹打充分混匀，使卵子悬浮于培养基中。

通过收集受精卵并将其分装到玻璃管中开始去壳。使用手动离心机，以1200 ×g离心受精卵约20秒，然后缓慢停止离心。用巴斯德吸管除去沉淀中的ASWH。

向每管沉淀中加入 4 毫升活化的去壳液。使用经自来水处理的巴斯德吸管（顶端连接一个小橡胶吸头），轻轻吹打悬浮合子。溶液应在 1 至 3 分钟后变为微黄色。

去卵膜过程中，使用巴斯德移液管从去卵膜悬浮液中取出少量等分试样。将一滴液体滴加到载玻片上，在解剖显微镜下观察。反复吹打受精卵悬浮液，每隔20至30秒检查一次载玻片。

首先卵泡细胞脱落，然后卵膜变黄且不透明，最后从合子上脱离。去膜后的粉红色合子会沉入玻璃管底部。当超过50%的合子已完成去膜后，向管中加满ASWH。

非常轻柔地离心约10至15秒，仅需使去壳的受精卵沉淀即可。缓慢停止离心。移除玻璃管中几乎全部液体，包括任何漂浮物，并用ASWH替代。

缓慢吹打以洗涤，然后同前轻轻离心。重复洗涤直至无卵膜碎片残留。将洗涤后的去卵膜合子在硅化处理的1.5毫升离心管中通过重力沉降。

沉淀后，将 ASWH 去除至管壁上 100 微升刻度处。现在用巴氏吸管向一个受精卵管中加入 250 微升预先配制好的甘露醇溶液中的 DNA。轻轻混匀，并立即把混合液转移至 4 毫米电穿孔比色皿中。

将比色皿放入电穿孔仪的电击槽中，在50伏特下施加一次持续16毫秒的单脉冲。然后使用同一支巴斯德吸管将受精卵从比色皿中移出，并转移至含有新鲜过滤人工海水（ASWH）的培养皿中。轻轻晃动培养皿使受精卵均匀分散。

将移液器在盛有ASWH的烧杯中冲洗，然后继续处理下一个样品。电穿孔所有合子后，将合子置于15至20摄氏度条件下培养。在温度控制为18摄氏度的冷却室内设置显微操作仪。

将塑料管和持针器连接至一个装有矿物油的10毫升玻璃注射器。用油反向填充管路和持针器，并排出所有气泡。将含有0.5微升含绿色活性染料注射液的注射针插入持针器中。

将固定器安装到显微操作仪上。调节持针器，使其沿与表面成45度角的直线移动。将去壳卵整齐排列于经琼脂糖包被的小型培养皿的凹槽内，以便在解剖显微镜下逐个进行显微注射。

如有必要，可将针尖轻轻抵住置于琼脂糖上的玻璃盖玻片，以折断针尖。施加轻微压力以确认针尖已打开。逐个注射未受精卵，先将针插入卵中，然后轻微抽吸以破坏卵膜。

然后，将绿色注射液注入卵细胞中央，注射体积最多不超过细胞直径的三分之一。注射完成后，移出注射针，将已注射的未受精卵转移至新的培养皿中，并在15至18摄氏度条件下孵育，直至受精。本研究采用显微注射技术，以分析海鞘（Ciona intestinalis）胚胎原肠胚阶段髓鞘转录因子（MyT）的调控机制。

通过原位杂交检测，在野生型中可观察到内源性表达出现在第六行神经板前体细胞中。显微注射吗啉代寡核苷酸以敲低早期胚胎因子（如转录因子Forkhead box A）会导致MyT整体表达消失。相反，当nodal表达下调时，MyT表达在侧向神经索前体细胞中异位激活，表明nodal通常抑制这些细胞中MyT的表达。

转录因子 GATAa 被标记了 Venus 标签，并在 pfog 驱动下电穿孔导入外胚层分裂球。如图所示，GATAa 主要定位于细胞核内，这符合转录因子的预期定位特征，而 Venus 的表达则普遍存在。

观看本视频后，您应能充分掌握如何对同步化的海鞘受精卵进行电穿孔瞬时转染，如何处理脆弱的去壳胚胎，以及如何找到显微注射的正确角度。这些技术随着胚胎的发育，为功能基因组学研究奠定了基础，可用于探索基因功能、基因调控网络以及在人类组织形成中同样重要的保守发育模块。