通过计算机追踪检测的嗅觉行为 果蝇 四象限嗅觉仪中

本实验装置的总体目标是利用提供的自动化果蝇追踪软件脚本，在四象限嗅觉仪中检测果蝇的嗅觉行为。该方法有助于解答关于嗅觉神经系统如何感知外部环境，以及大脑如何解码并引导行为决策的关键问题。该技术的主要优势在于其多功能性和稳健性，能够在较大的实验区域内对果蝇群体进行多次重复测试以评估其嗅觉反应。

本实验方案中，准备五个气味室，每个气味室由一个塑料外容器、一个玻璃内容器以及一个定制的聚四氟乙烯（PTFE）盖插件组成。该插件是在原始容器盖中央部分被移除后制成，并配有两个单向阀。使用其中四个气味室作为溶剂对照，一个气味室用于测试气味物质。

确保每个小室清洁，然后向气味容器中加入一毫升溶剂或气味稀释液。接着检查容器在塑料小室中的位置，确保没有液体洒出。使用螺口盖和聚四氟乙烯（PTFE）插件上的O形圈密封盖子，以防泄漏。

在标准玉米粉培养基上饲养果蝇。在标准培养瓶中放入30只雄蝇和30只雌蝇，于室温下让其产卵五天。从此类培养瓶中收集新羽化的果蝇。

对于每个实验组，收集25只雄性和25只雌性果蝇，在短暂的二氧化碳麻醉下操作，并将该组果蝇置于标准果蝇培养基中饲养2至4天。在实验开始前40至42小时，将果蝇组转移至含有约10毫升1%琼脂糖凝胶的试管中，以提供湿度但不提供食物。饥饿处理有助于增强果蝇的整体运动活性，且超过90%的果蝇应能存活通过饥饿过程。

如果死亡率超过10%，这在弱基因型中可能发生，则尝试对实验中所有果蝇进行一天的饥饿处理。至少提前五分钟打开温度控制器，并将其设定为25摄氏度。然后，通过塑料管将气味室与实验区域连接。

使用电子流量计检测实验区域每个象限的气流速率。确保对照气流和气味气流的流速均为每分钟100毫升。果蝇对气流非常敏感，因此每次实验前必须确认每个象限的气流速率准确无误。

现在，使用70%乙醇清洁实验区域和玻璃板。将所有部件擦拭两到三次，并在继续下一步之前使其完全风干。接下来，将玻璃板固定在实验区域上。

然后，将果蝇转移至实验 arena 中，无需麻醉。利用重力使果蝇通过其中一块玻璃板上的孔洞进入，随后用圆形网膜盖住孔洞。接着，将装有果蝇的 arena 置于避光暗室中。

然后，将四个对照气流分别连接至每个实验区域的四个角落。关闭培养室的门，让果蝇在新环境中适应10到15分钟。适应期结束后，进行一次5到10分钟的对照实验，使果蝇暴露于四个对照气流中。

现在必须立即分析数据。如果果蝇在实验区域中分布不均，则必须重置实验区域。测试对照果蝇对纯净空气的行为反应至关重要。

这将快速验证所有背景条件是否正常。漏光、温度不均、 arena 倾斜或气味污染均可能导致问题。如有必要，弃去果蝇并再次清洁 arena。

如果怀疑存在气味物质污染，请更换所有管路。持续使用新的动物群组重复对照实验，直至动物对四个象限均无偏好性。随后，使用三通阀将测试气味物质腔室连接至装置，或重新连接管路，并运行一次5到10分钟的测试实验。

对于较长时间的实验记录，每20分钟需快速停止并重新启动追踪程序，否则数据文件会过大。每次测试之间，弃去果蝇，用70%乙醇清洁实验区域和玻璃板，并更换连接管。保持干燥气流持续通入，以不断冲洗系统。

为了提高效率，最好准备两个实验区域，以便在进行实验的同时清洁另一个区域。如果同一天内多个实验出现问题，需格外注意确保系统中没有残留之前实验的气味。通常情况下，低浓度的气味物质或CO2不会造成此类问题，但对于高浓度的刺激物，可能需要在两次实验之间留出长达24小时的间隔。

对于数据分析，使用提供的自定义 Matlab 程序将数据转换为 Matlab 格式。加载由追踪软件实时生成的原始数据文件，并创建一个沿实验区域轮廓的空間掩膜。将该掩膜应用于原始数据，以去除所有落在实验区域外的数据点，因为这些数据点代表噪声。

然后，移除所有移动速度低于每秒0.163厘米且持续时间超过三秒的数据点。这些数据很可能是噪声或未移动的果蝇。现在，通过绘制整个记录期间的所有剩余数据点来可视化这些数据。

数据也可以单条轨迹的形式进行观察。可根据果蝇行为数据快速估算气味边界。然后，计算趋化指数，并按照文本方案中所述进行统计检验。

在行为实验装置中测试了25只雄性和25只雌性果蝇。在干燥空气刺激下，果蝇对整个实验区域进行探索，无任何象限偏好。线条显示了一只果蝇的追踪轨迹。

当将苹果醋引入左上象限的气流时，大多数果蝇被吸引至该气味象限。当在左上象限引入驱避性气味物质10%丙酸乙酯时，果蝇则避开该象限。该象限的吸引指数为0.68。

趋性指数是嗅觉反应测量中最常用的指标。数值大于或小于零分别表示吸引或排斥。该脚本对不同试验间实验区域位置的微小差异进行了校正。

可能为噪声或非活动果蝇的数据点已被剔除。尽管该实验可运行任意时长，但以每10秒为一个时间区间观察群体运动的变化，有助于理解气味适应及其他现象。观看本视频后，您应能够充分掌握如何有效开展并分析四区域实验中的嗅觉行为。

一旦掌握，每项嗅觉实验大约可在一小时内完成，我们通常每天进行四到六项实验。