一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

本实验方案的总体目标是提供一种非侵入性且技术要求不高的方法，用于在小鼠中诱导细菌性肺炎，并随后对肺部的体内宿主防御反应进行定量分析。该方法有助于解答传染病学和免疫学领域中的关键问题，例如调控宿主对感染反应的基因和分子通路。这种肺部感染方法的主要优势在于其技术上的简便性。

这使得即使缺乏肺部操作经验的实验室也能研究肺部先天免疫反应。在生物安全二级实验室中，将一管肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）甘油菌种解冻，并取1毫升菌液转移至含有50毫升胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth）的500毫升培养瓶中。将菌液悬浮物在37摄氏度、200至225转/分钟的条件下振荡培养过夜。

次日早晨，取1至5毫升细菌培养物，加入含有50毫升胰蛋白胨大豆肉汤的新锥形瓶中进行稀释，并将培养物置于摇床中，于37摄氏度继续培养2.5小时，以达到对数生长期。第二次培养结束后，从第二次培养物中转移1毫升细菌至1.5毫升离心管中，进行离心。离心后小心去除上清液，避免扰动沉淀，然后用1毫升无菌生理盐水轻轻重悬细菌沉淀，重复洗涤三次。

第三次洗涤后，将细菌重悬于另一毫升无菌生理盐水中，并对菌液进行对数级系列稀释。取1:10和1:100稀释液各一毫升，分别加入一次性比色皿中，每种设置两个重复，用于测定洗涤后肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）的OD600值。OD600为1.0时，大约相当于每毫升含有4×10⁸至7×10⁸个菌落形成单位（CFU）。

在计算各稀释度细菌浓度后，将所需接种量的菌落形成单位（CFU）重悬于每只8至12周龄受体动物50至60微升无菌生理盐水中。为将细菌接种至动物体内，用P200移液器吸头吸取接种物，将麻醉后的小鼠置于倾斜有机玻璃板上，通过橡皮筋固定于板上凸钉之间，使小鼠以上颌门齿悬挂，呈半仰卧位。使用一对钝头、无齿镊子，轻轻将舌头拉向一侧，将接种物滴入动物口腔内，注意避免对舌头或口咽部造成损伤。

保持舌头回缩，用戴着手套的手指轻轻堵住鼻孔，直到小鼠吸入两到三次。当口腔内看不到液体时，将小鼠从接种板转移到笼中，保持仰卧位，以防止小鼠恢复期间鼻孔堵塞。在胸骨下方做一个纵向切口。

然后用镊子提起胸骨，剪开膈肌，使肺自然回缩至胸腔内。沿血管两侧继续向上剪开胸腔，并延伸切口至颈部。当气管可见时，小心地从颈部中央剪开，并将周围组织推向两侧，以避免损伤周围的血管结构。

现在从靠近头部约四分之一处切开气管，并向尾端插入连接有1毫升注射器的套管，注射器内预先装有1毫升PBS。缓慢将液体推入肺部，使所有肺叶充分膨胀。然后用注射器将液体回抽，并将收集的灌洗液汇集至一个15毫升离心管中，置于冰上。

在适当的实验终点，从左心室采集血液，并转移至含肝素的试管中以防止凝固。随后，将所有肺叶收集到含有5毫升PBS的15毫升试管中，脾脏收集到含有2毫升PBS的15毫升试管中。接下来，每个样本使用独立的一次性匀浆器在冰上进行组织研磨，然后对组织悬液进行连续梯度稀释。

将稀释液分别接种于同一块TSA平板的两侧，每个稀释度设两个重复，待样品短暂干燥后，倒置平板，于37°C静置培养箱中过夜培养。次日早晨，统计平板两侧的细菌菌落数，并对每个稀释度的菌落数取平均值。当小鼠感染的肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）数量达到2000 CFU时，通常在感染后12至24小时内开始出现临床症状。

在感染后的48至72小时内，许多动物会出现疾病症状和发病表现，通常在出现症状前体重平均下降20%。然而，使用LD50剂量可以检测实验组中相对升高或降低的存活率，因此更适合用于长期研究。肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）引起的下呼吸道感染特征是在感染后6小时内白细胞大量涌入气道，24小时达到高峰，且主要以中性粒细胞为主。

在肺炎克雷伯菌感染后24小时和48小时，均可在支气管肺泡灌洗液中检测到细胞因子，这有助于了解肺部微环境及其在细菌侵入后所启动的免疫自我招募反应。感染后24至48小时内，肺、血液和脾脏中的细菌载量也显著增加。一旦掌握，若操作得当，经口咽吸气法建立肺部感染模型每只小鼠仅需1至2分钟。

进行该操作时，需注意切勿使用过大的吸液体积。对于8至12周龄的小鼠，通常使用50至60微升的体积效果较好。完成该操作后，可对肺组织及外周组织采用多种方法进行检测，以定量分析免疫反应在病原体清除中的作用。

观看本视频后，您应充分了解如何通过口咽部病原体递送诱导实验性细菌性肺炎，以及如何测定小鼠体内的病原体载量。请务必注意，操作微生物可能存在危险，在进行本实验操作时，应始终采取基本的BSL-2级防护措施和操作规范。