一种用于小鼠继发性细菌性肺炎模型的精准病原体递送与回收系统

本实验的总体目标是通过提供一种简便且无创的细菌接种途径，将细菌接种至下呼吸道，随后进行细菌回收并纯化RNA以用于转录分析，从而促进继发性细菌性肺炎的研究。该目标将通过以下步骤实现：首先，对小鼠进行深度麻醉，并将预先装有菌液的钝头弯针插入已通过上颌门齿垂直悬挂的小鼠气管中；其次，在成功感染后，通过切除肺组织并进行匀浆处理，回收细菌菌落形成单位。

将所得肺组织匀浆进行连续稀释后，接种于营养琼脂平板，以计数菌落形成单位。最后，从肺组织匀浆中纯化RNA。该方法的优点在于可实现向下呼吸道的直接、可控递送。

这使我们能够研究病原体对疾病结局的组合性及个体性贡献。该领域的最新进展表明，细菌基因调控可能在决定感染结局中发挥重要作用。该技术的优势在于能够同时回收细菌菌落形成单位（CFUs）和RNA。

RNA 提取后，我们便可评估特定毒力基因在感染过程中的作用。此外，该技术无需手术操作，具有非侵入性的优势。这能够最大程度减少实验动物所受的应激，使其在操作后迅速恢复。

该操作无需使用任何类型的套管、导丝或光纤电缆，仅需常规实验室设备即可完成。初学者在初次尝试经气管安装时可能会遇到困难。一旦掌握了该技术的原理，便可成为一种在小鼠体内检测继发性细菌性肺炎的简单而有效的方法。

在开始操作前，使用以下物品准备操作区域：插管平台、一支无菌的1 mL注射器、无菌钝头镊子、无菌21号钝头针头，以及两个锥形管用于存放注射器和镊子。首先配制病原体接种液，使其在50 µL体积中达到所需的最终浓度。接着，戴上无菌手套，取一支1至1.5英寸长的21号钝头针头，将其弯曲成约35度角。

将针头固定到注射器后，先抽取100 µL空气垫，随后抽取50 µL的感染性物质。100 µL的空气垫可确保在按压注射器时病原体完全排出。将装好液体的针头和注射器放置在惯用手易于取用的位置。

将小鼠从麻醉室中取出并麻醉，然后将其上颌门齿悬挂在插管平台之上。使用钝头镊子轻轻夹住并拉出舌头。将舌头从镊子转移至非惯用手的拇指和食指之间。

用非优势手继续固定舌头，并拿起预装好的注射器。将针头弯曲端朝向远离身体的方向。将针头插入口腔内。

在舌根底部，轻轻倾斜手腕，使针头略微向外偏离身体方向。此操作可确保针头进入气管而非食管。缓慢将针头导入气管内。

当针穿过声带时，通常会感觉到轻微的阻力。将针穿过气管，直至针尖遇到气管隆嵴时感到轻微阻力。然后将针尖轻轻向上抬起，使针悬停在气管隆嵴上方。

这可以将物质递送至主支气管。完全下压注射器活塞以注入感染物。将针头从气管中取出并丢弃。

通过松开橡皮筋将小鼠从插管平台上取下，但需保持小鼠处于直立位置。用手指直接按住鼻孔以阻塞鼻腔气道。保持此姿势约一分钟，或直至观察到数次深呼吸为止。

这最后一步可确保将全部接种量递送至下呼吸道。将动物放回笼中，并确保其从麻醉中迅速恢复。在选定的感染后时间点，可切除感染的肺组织，以定量并评估细菌对继发性细菌性肺炎相关发病率升高的影响。

准备一个工作区，配备以下物品：天平和无菌称量舟、解剖平台、包含剪刀和镊子的解剖工具包，以及无菌纱布。本演示中，肺组织的切除将在实验台面上进行。然而，为了在整个操作过程中维持无菌状态，建议在层流净化台内进行肺组织切除。

使用 CO2 或其他经 IACUC 批准的安乐死方法处死感染小鼠。将感染小鼠放置并固定在解剖平台上。用乙醇喷洒小鼠体表，以维持操作表面的无菌状态。

从脐部开始，用一把镊子提起皮肤，并向喉部方向做一切口。抓住初始切口两侧的皮肤，将其从身体上拉开，并切断组织连接。可横向在皮肤上做侧向切口，以充分暴露胸腔区域。

从剑突基底部开始，做一个小切口，目的是刺破膈肌。这会导致胸腔内压力升高，从而使肺组织回缩。在肺组织回缩后，继续切开以游离膈肌。

通过在两侧做切口去除肋骨。这将暴露胸腔和肺。要切除肺部，用镊子夹住心脏基部并向上提起。

将剪刀置于肺部后方，开始在组织连接处进行小切口，同时继续向上提起心脏。肺部切除后，将其放置于无菌纱布上，并通过向上提离肺部并剪断剩余的组织连接来取出心脏。将肺组织转移至已去皮重的称量舟中，记录质量。

在称量肺脏后，将肺脏转移至无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并暂时置于冰上保存。现在肺脏已切除并称重完毕，可进行细菌回收，以确定其在发病机制中的作用。为准备细菌回收，需要以下物品：组织研磨器、无菌无RNase的PBS、添加了β-巯基乙醇的RLT缓冲液，以及1.5 mL无RNase的微量离心管。

首先向组织研磨器中加入 1 mL 无菌无 RNase 的 PBS。加液后，将组织研磨器置于冰上保存。接下来，准备一系列无菌无 RNase 的连续稀释管，用于定量从感染肺组织中回收的细菌载量。

将肺组织转移至已准备好的组织研磨器中，通过按压底座并同时旋转，充分匀浆组织。打开组织研磨器，取100 µL匀浆液加入已准备好的系列稀释管中的第一管。对样品进行系列稀释后，接种于营养琼脂平板，以计数菌落形成单位。

菌落形成单位（CFUs）可以记录为每毫升的CFUs，或每毫克肺组织的CFUs。在移取100微升等分试样后，重新安装研磨底座，并在4℃条件下以4,000 rpm离心样品10分钟。离心完成后，从沉淀样品中移去上清液。

上清液可保存并在-80摄氏度下储存，以备日后进一步分析。将匀浆后的组织沉淀物重悬于700 µL RLT缓冲液（含β-巯基乙醇）中，并将样品转移至无RN酶的无菌1.5 mL离心管中。此时样品可在-80摄氏度下保存。

可通过将样品加入含有1毫米二氧化硅珠的2 mL微量离心管中，并以每秒六米的速度使用珠磨机处理20秒，从RLT肺匀浆液中纯化RNA。随后立即采用Voyich等在《分子生物学方法》2008年报道并在此视频配套文稿中描述的RNeasy方法改良方案进行RNA纯化。

纯化完成后，可使用分光光度计测定RNA的得率。定量后，建议将所得RNA稀释为每微升50纳克的多个等份。这样可使样品中的RNA用于多次分析，同时避免反复冻融。

该技术的应用能够将可控的病原体负荷直接导入下呼吸道。通过注入1%考马斯亮蓝溶液，可验证该递送系统的效率。上排显示一对未感染的肺组织作为对照，下排显示一对通过气管内注入接受50 µL 1%考马斯亮蓝染料的肺组织。

使用这种染料可证明气管内接种如何将病原体负荷均匀分布至左右两侧肺部。感染后，可通过切除并匀浆肺组织，在气管内接种后的不同时间点回收并分析病原体负荷量。为了验证该回收技术的效率，将两组小鼠（每组三只）分别用低剂量和高剂量的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进行感染。

将细菌接种物涂布于营养琼脂平板上，以计数菌落形成单位（CFUs）。气管内接种后1小时，处死小鼠，取出肺组织并在组织研磨器中匀浆。将匀浆后的组织进行系列稀释，然后涂布于营养琼脂平板上，以计数菌落形成单位（CFUs）。

从匀浆化的肺组织中分离得到的RNA可通过逆转录PCR进行检测，并用于定量目标基因的相对转录本丰度。为确保DNA背景污染最小化，建议在进行任何定量逆转录PCR（qRT-PCR）反应的同时，平行运行一组不加入逆转录酶的PCR反应。除了细菌载量外，该技术还可拓展应用于病毒载量的接种与分离。

肺组织匀浆后，可提取病毒RNA，用于检测病毒基因的转录丰度或构建病毒定量的标准曲线。该系统的应用为研究继发性细菌性肺炎提供了一种高效且可重复的实验方法。掌握该技术后，可用于大规模实验研究。

以分批方式对小鼠实施安乐死后，每只小鼠的气管内灌注操作可在30秒内完成。操作完成后，进行肺组织的切除，每只小鼠约需2至3分钟。尽管本文讨论的方法是在继发性细菌感染的背景下进行的，但该技术可推广至任何需要对接种物进行可控递送与回收的实验操作中。

除了此处描述的方法外，还可在切除肺脏之前增加支气管肺泡灌洗步骤以补充本实验流程。尽管该操作常导致病原体载量的回收率降低，但其优势在于可获得细胞因子分析、乳酸脱氢酶活性以及不同细胞群体鉴定等相关数据。为了更全面地理解疾病发病机制，对宿主和病原体在疾病发生中的作用进行综合分析显得尤为重要。

本视频旨在提供一种简单高效的方法，用于研究小鼠宿主中的继发性细菌性肺炎。