同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

该技术的总体目标是以多重方式快速筛选自身抗体。该方法有助于阐明自身免疫领域的关键问题，例如哪些自身抗体与不同的疾病状态相关。该技术的主要优势在于可并行筛选自身抗体，仅需微升级别的血清以及微克级别的抗原。

为制备抗原微阵列，首先将抗原用 PBS 稀释至终浓度为 2 毫克/毫升。设置包含九根点样针的微阵列点样仪，以同时重复点样最多 162 种不同的抗原。在抗原文库中加入 IgG 和 IgM 抗原作为阳性对照。

仅以 PBS 作为阴性对照。将每种抗原各 20 微升，按照与打印头设置相对应的分组方式加入 384 孔源板中。用铝箔覆盖源板，并在 -80 °C 冻存，直至准备打印芯片阵列。

将固体微阵列针在去离子水中置于超声波清洗机中孵育，每次一分钟，重复三次。将针放入支架中晾干。然后将针排列在微阵列打印头中。

对于九针，使用三乘三的排列方式。接下来，通过设置打印头上的针数、待打印的载玻片数量、每张载玻片上的点样区域数量以及每种抗原的重复点样次数，对微阵列仪进行程序设定以执行打印。此外，设定微阵列仪在不同抗原组之间用水对针头进行超声处理。

接下来，在解冻源板后，以100 × g离心1分钟。将源板放置于微阵列仪指定位置，然后移除将要打印的第一组抗原上方的箔膜。将未打印的玻片排列在阵列仪表面，运行打印程序。在室温下进行打印，同时将阵列仪的湿度设置为55%至60%。每完成所有玻片上第一组抗原的打印后，暂停微阵列仪。

用铝箔覆盖刚刚点样的抗原，以防止蒸发，并揭开下一组待点样的抗原。然后继续运行打印程序。所有抗原点样完成后，用新的铝箔覆盖源板，并在负80摄氏度下冷冻保存。

将打印好的载玻片放入载玻片盒中，并进行真空密封。载玻片可在第二天使用，或在一个月内使用。若要使用孵育室通过稀释的血清孵育微阵列，请将载玻片放入框架中。

然后向每个芯片表面加入 700 µL 封闭缓冲液。将粘性封膜覆盖在框架上，并将其转移至含有湿纸巾的密封容器中。随后，将玻片置于 4 °C 摇床中孵育过夜。

第二天，用封闭缓冲液将血清样本稀释至1:100。然后吸去芯片上的封闭液，向每个芯片表面加入500 µL稀释后的样本。接着，用粘性封膜覆盖芯片，并在4°C条件下轻轻振荡孵育1小时。

然后，从芯片上吸出血清样本，并通过将洗涤缓冲液倾倒至载玻片表面并迅速甩去的方式，重复冲洗芯片表面四次。每次使用700 µL封闭缓冲液洗涤每个芯片表面，并在室温下轻轻振荡孵育10分钟。随后，向每张载玻片表面加入500 µL稀释后的二抗溶液，并用粘性封膜覆盖。

将切片置于4°C，摇动孵育45分钟。孵育结束后，吸去切片上的二抗混合液，并按前述方法清洗四次。随后用700 µL封闭稀释缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。

从框架中取出载玻片，然后将其放入金属载玻片架中，并浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。在室温下以旋转振荡方式孵育20分钟。将载玻片架放入去离子水中浸泡15秒。

然后将支架放入新的水容器中，再孵育15秒。干燥载玻片时，将载玻片架置于离心机中的ELISA板适配器上，在220 ×g和室温条件下离心5分钟。将载玻片放入避光盒中，直至准备扫描。

扫描玻片时，使用能够检测SI三和SI五荧光信号的微阵列扫描仪。通过预扫描一张仅用二抗孵育的完整抗原文库玻片，确定最佳的光电倍增管（PMT）设置。按下硬件按钮设定PMT值，使SI三通道上的人IgG特征信号与SI五通道上的人IgM特征信号具有相似的中位荧光强度减去背景值（MFIB），该值通常为40,000。

接下来，按下扫描按钮，在两个通道中扫描实验载玻片。每次扫描后，保存两个通道的载玻片图像。使用文件按钮，将待分析的载玻片加载到微阵列软件中。

然后，使用文件按钮加载基因阵列列表（GAL 文件），该文件包含阵列的布局及阵列特征的标识信息。将阵列模板覆盖在扫描图像上，使阵列特征与模板尽可能对齐。按下对齐按钮，使所有区块中的特征与模板对齐。

软件将随后计算每种抗原的平均荧光强度减去背景值。最后，使用文件按钮将结果导出为文本文件，并根据文本方案分析数据。在本图中，显示了阳性和阴性对照切片，阴性对照切片仅用二抗进行孵育，而阳性对照切片则用系统性红斑狼疮患者血清进行孵育。

如图所示，已知对核糖体P蛋白（riboP）具有反应性的阳性对照血清显示出针对单链DNA的IgM抗体以及针对核糖体P蛋白的IgG抗体。在所有血清稀释度中，IgM均呈现线性反应，而IgG的反应则呈线性直至MFI减去背景值达到约30,000。在本实验中，芯片使用来自一名患有冷球蛋白血症性血管炎患者的血清进行检测，该患者已证实存在类风湿因子，即针对IgG的IgM抗体。

由于患者血清中的IgM与阵列上固定的IgG结合，IgG特征呈现黄绿色。仅使用二抗时，未见IgM对点样在阵列上的IgG产生反应性。此处显示，点样在阵列上的小鼠IgM和IgG仅分别通过抗小鼠IgM和IgG的二抗检测到。

该图显示了使用微阵列分析软件将模板网格与扫描的阵列图像进行对齐。对齐后，可分析阵列上的各个特征，以获得每个特征的中位荧光强度减去背景值。若操作得当，掌握技术后，抗原微阵列的检测可在四小时内完成。

完成此操作后，可进一步采用其他技术（如酶联免疫吸附试验）来验证抗原微阵列所获得的结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备抗原微阵列、如何利用血清对抗原微阵列进行探查，以及如何使用扫描仪对抗原微阵列进行扫描。请务必注意，操作人血清可能存在生物危害，因此在执行本实验时应采取通用防护措施。