腺病毒转染：通过耗竭-拯救实验研究分子伴侣在细胞形态动力学中作用的方法

该方法的总体目标是能够在保持细胞完整性和蛋白质稳态的条件下进行耗竭-挽救实验，从而在单细胞水平上对生物过程进行功能分析。

该方法有助于解答有关蛋白质功能及其在细胞动态过程（如有丝分裂和细胞分化）中结构需求的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在大部分细胞群体中，将近生理水平的目标蛋白质去除的同时，重新引入该蛋白质的变异体。

首先用纤维连接蛋白包被玻璃底培养皿。具体操作为：用无菌 PBS 将浓度为 1 毫克/毫升的纤维连接蛋白储备液按 1:100 比例稀释。

向每个35毫升培养皿中加入1毫升溶液，以覆盖整个表面。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育期间，将添加了10%胎牛血清的α-MEM培养基和0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37摄氏度。

孵育45分钟后，开始准备细胞悬液。从一个10厘米的HeLa-RFP-H2B细胞培养皿中吸除培养基，并用1.5毫升0.05%胰蛋白酶EDTA轻轻冲洗两次。

最后一次吸液后，在培养板中留下 0.5 毫升胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育细胞 2 至 3 分钟。

轻轻敲击培养板，在显微镜下观察细胞层，以确认所有细胞均已脱落。然后加入 10 毫升培养基，轻轻吹打数次以分离细胞，并将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。

使用血细胞计数板对10微升细胞悬液样本进行计数。接着，从玻璃底培养皿中吸除纤连蛋白溶液。在接种细胞前，切勿让纤连蛋白干燥。

制备细胞悬液，每2毫升培养基中接种1.5 × 10⁵个细胞至35毫米培养皿中。根据实验条件数量，额外多接种一个35毫米培养皿，用于病毒转导前的细胞计数。在培养箱中孵育30至45分钟。孵育结束后，在显微镜下观察细胞，确保细胞分布均匀，如图所示。随后将培养皿放回培养箱，继续培养至次日。

接种后的第二天，确保细胞密度至少达到50%。细胞密度低于50%会导致病毒转导效率降低、单个细胞的蛋白表达差异增大以及细胞毒性增加。随后，按照之前的方法从额外接种的培养皿中收集细胞并计数。计算实现高效转导所需的病毒体积。为每种实验条件标记一个1.5毫升微量离心管，并向每管中加入400微升预热的不含血清的α-MEM培养基。将病毒分装液在冰上缓慢解冻后，将所需体积的每种病毒加入对应管中，并用移液器轻轻吹打混匀。接着，吸除细胞培养皿中的培养基，然后逐滴加入病毒混合液。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在1小时的时间内，每隔15分钟，在无菌操作台内轻轻摇动培养板，使病毒均匀覆盖细胞。使用少量培养基有助于病毒与细胞充分接触。

孵育后，轻轻吸取 1.6 毫升不含添加剂的 α-MEM 培养基加入每孔板中，使总体积达到 2 毫升。随后加入 2 毫摩尔的胸腺嘧啶核苷以启动细胞同步化，再将细胞继续孵育 2 小时。

同时，在微量离心管中加入 139 微升无菌水、50 微升 1 摩尔氯化钙和 11 微升 20 微摩尔 siRNA，配制 siRNA 转染混合液。若无需 siRNA，可用无菌水替代 siRNA 的体积，以进行空载转染。将 2× HBSS 溶液逐滴缓慢加入氯化钙-siRNA 混合物中。使用 200 微升移液器通过空气吹打轻轻混匀两次，较小的沉淀物有助于提高转染效率。随后在室温下孵育该混合物 30 分钟。孵育结束后，将 200 微升混合液缓慢逐滴加入每孔中，并轻轻振荡混匀。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。

第二天，从培养箱中取出培养皿，转移至组织培养操作台。用两毫升预热的 HEPES 缓冲液冲洗细胞两次后，加入两毫升不含 HEPES 的 α-MEM 培养基，然后放回培养箱中继续培养。

7 小时后，在培养板中加入 2 毫摩尔的胸腺嘧啶核苷，然后将培养板放回培养箱。每次操作最多处理四块细胞培养板，因为温度变化会影响细胞周期的长度。第二天，即 siRNA 转染和病毒感染 48 小时后，用 2 毫升预热的 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 2 毫升不含酚红的 α-MEM 培养基用于活细胞成像。继续培养 7 小时。

使用配备有加湿、5%二氧化碳、温控培养室的倒置显微镜，对有丝分裂细胞进行短期活细胞成像实验。在开始采集图像前，需确认培养室温度已达到适宜的37摄氏度。

在采集图像前一小时，将培养皿放入显微镜载物台腔室，以使培养基充分平衡，并避免因温度变化导致的焦距漂移。检查细胞的有丝分裂状态。此时，应有10%至15%的细胞处于有丝分裂的早期阶段。

在平衡时间内，根据先前实验确定的条件设置采集参数。需在避免光漂白的前提下获得适当的分辨率，因为光漂白会导致细胞损伤并干扰有丝分裂进程。每种条件下选择多个含有处于有丝分裂起始阶段细胞的视野，以获得足够数量的待分析细胞，同时不超出采集时间间隔。选定所有视野后，重新调整焦距，并尽快开始图像采集。

使用转盘共聚焦系统时，典型的实验设置应包括四种不同条件，每孔七个工作区域，两个荧光通道，在75分钟内以1.5至2分钟的时间间隔进行成像。应确定明确的分析标准，用于评估细胞有丝分裂表型，具体标准取决于所使用的荧光标记物。

与转染BAG3-GFP质粒DNA（如左图所示）相比，使用此处所示的重组腺病毒进行腺转染（adenofection），可在较低感染复数下使细胞群体中大多数细胞实现更均一且高效的BAG3-GFP表达。该代表性Western印迹结果显示，通过使用靶向BAG3的特异性siRNA和重组腺病毒BAG3-GFP进行腺转染，可有效耗尽内源性BAG3蛋白，并将近似内源性水平的BAG3-GFP蛋白重新引入细胞。如图所示，腺转染能够维持蛋白质稳态，因为在接受腺转染的HeLa细胞中，应激诱导的热休克蛋白水平未见明显升高；而相比之下，经蛋白毒性应激诱导剂MG132处理的HeLa细胞则表现出明显升高。此处可见，腺转染对细胞有丝分裂进程无显著干扰，这一点由经对照siRNA以及BacMam-GFP标记的α-微管蛋白和BacMam-RFP标记的肌动蛋白腺转染的HeLa细胞的共聚焦延时成像结果所证实。

该图显示了发生异常有丝分裂的细胞比例。仅转染BAG3特异性siRNA的细胞，其有丝分裂缺陷水平显著升高，约为对照组的两倍，如红色柱所示；而重新引入BAG3-GFP后，缺陷水平恢复至接近对照细胞水平，如黑色柱所示。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用腺病毒转染技术进行耗竭-挽救实验。该方法提供了一种快速且简便的系统，可在多种细胞背景下构建功能部分缺失的基因敲低模型，用于结构与功能分析。通过该方法，可确定目标蛋白在特定功能中所需的关键结构域。随后可结合其他基因组编辑技术，进一步深入探究其作用机制。