细胞内复性实验

以下实验的总体目标是测量热休克后依赖分子伴侣的细胞内蛋白质重折叠过程。首先使用携带荧光素酶报告基因和目标分子伴侣的质粒转染细胞，以建立荧光素酶报告系统。然后根据实验设计将转染后的细胞分组，用于不同恢复时间点的检测。

第二天，对细胞进行热激以诱导蛋白质去折叠。随后让细胞恢复，以重建细胞内蛋白质的正确折叠，然后检测荧光素酶报告基因活性。实验结果通过荧光素酶检测，反映蛋白质复性的时间依赖性和分子伴侣依赖性。

与现有方法（如体外复性分析）相比，该技术的主要优势在于能够获得化合物或蛋白质对分子伴侣活性影响的更接近生理状态的读数。该技术的应用可拓展至多种疾病的治疗，例如神经退行性疾病或癌症，因为分子伴侣在这些疾病的发病过程中发挥着重要作用。首先，将培养基、PBS 和胰蛋白酶在水浴中预热至 37 摄氏度。

用 5 毫升 PBS 洗涤汇合的 HEK 293 细胞培养物。然后加入 1 毫升含 0.025% EDTA 的胰蛋白酶，轻轻旋转培养皿使胰蛋白酶均匀分布，并在 37 °C 下孵育。定期轻摇培养皿以确认细胞脱落情况。

现在将细胞重悬于10毫升完全DMEM培养基中，并转移至50毫升Falcon管中。然后使用Beckman计数板对细胞进行计数。将细胞接种至约60%至70%汇合度，并孵育6至8小时。

将 Extreme Gene 九试剂和无血清培养基的分装液平衡至室温，并将无血清培养基预热至 37 摄氏度。用移液器将无血清培养基加入两个离心管中。然后加入 Extreme Gene 九试剂，注意不要接触离心管管壁，在室温下孵育 5 分钟。

同时，在1号管中配制2D NA转染混合液，加入ran vanilla firefly和空载体对照；在2号管中加入ran vanilla firefly和分子伴侣。将DNA加入转染试剂混合物中，涡旋混匀，并在室温下孵育20分钟。

继续将此混合物加入已铺板的细胞中，并培养24小时。用胰蛋白酶消化转染后的细胞，以60%至70%的汇合度将细胞接种至6孔板中，置于培养箱中过夜。吸除转染细胞的培养基。

然后加入一毫升热激缓冲液，孵育30分钟。为终止新生蛋白的合成，用对苯甲醛条密封管盖，并在45摄氏度水浴中孵育30分钟。随后移除对苯甲醛条，将细胞放回培养箱中，在指定的时间点进行恢复。

收集细胞，并用 PBS 洗涤一次。为实现高效细胞裂解，将细胞沉淀在液氮中迅速冷冻，加入 200 µL 稀释的被动裂解缓冲液。然后分装成三份平行样，每孔加入 30 µL 细胞裂解液至 96 孔板中。

为了评估转染效率，首先使用未经电击的对照样品。为检测海肾荧光素酶活性，配制新鲜的反应缓冲液，其中包含0.2毫摩尔的荧光素、1毫摩尔的ATP和0.2微摩尔的辅酶A，溶于Gly-Gly缓冲液中。将96孔板插入化学发光仪，并启动程序。

Wallach 1420 工作站。将泵一插入含有 0.2 微摩尔依嗪反应缓冲液的 Falcon 管中。从菜单中选择“分配器维护”选项，并勾选泵一。

选择“填充”选项以编辑板布局。在菜单中选择“探索方案与结果”选项，然后选择该方案。

现在选择需要读取的孔。返回 Wallach 管理器，点击开始以测量样品发射光。在 482 纳米处，进入分配器维护，选择排空并启动泵一，将所有残留溶液回流至管中。

现在将管子转移到含有水和蜱虫的离心管中，冲洗。然后选择“空”。接着将一号泵的管子放入反应缓冲液中，将二号泵的管子放入荧光素溶液中。

更改板布局。选择泵一和泵二的填充。从分配器维护菜单中选择程序，并开始测量560纳米波长的萤光素酶反应。

重复结束后，再次重复该步骤：排空、冲洗、排空。对于泵一和泵二，在 Wallach 1420 Explorer 中查看结果。每次实验均与一项检测相关联。

输入用户名并设置起止日期，将结果导出为 Excel 文件。分析表明，蛋白质的重折叠过程与恢复时间直接相关。本实验中，在热激后的不同时间点对细胞进行评估。

在有或无分子伴侣的情况下。如预期所示，无论是在对照组还是在转染了分子伴侣的细胞中，随着恢复时间的延长，复性荧光素酶的百分比均增加。相比之下，无效数据集显示时间与复性之间相关性的R平方值较差。

采用这一技术后，还可以进行其他方法，例如体外TPAs测定，以回答更多问题，如分子伴侣酶活性的抑制作用。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何测量细胞内蛋白质。我们紧随热休克之后进行后续操作。