开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

本实验的总体目标是开发一种新方法，用于生成源自干细胞的、与炎症关节相关的调节性T细胞，以用于治疗自身免疫性关节炎的免疫疗法。该方法有助于解答自身免疫领域中的一个关键问题，即自身免疫性关节炎潜在的免疫治疗手段。该技术的主要优势在于，所获得的干细胞来源的调节性T细胞具有表型均一且为单一细胞类型的特点。

首先将感兴趣的饲养细胞用OP9培养基稀释至最低密度为每平方厘米1×10⁴个细胞，并在每个10厘米培养皿中接种1×10⁶个饲养细胞。当细胞融合度达到80%至90%时，吸除培养皿中的培养基，并在每个培养皿中加入0.5×10⁵至1×10⁵个经逆转录病毒转导的可诱导多能干细胞（iPSCs），使用OP9培养基进行接种。5天后，吸除培养基，并用10 mL PBS洗涤细胞。

随后，每皿加入 4 毫升胰蛋白酶，在 37 摄氏度下消化细胞。10 分钟后，加入 8 毫升 IPSC 培养基终止反应，并将细胞收集进行离心。将细胞沉淀重悬于 10 毫升新鲜 IPSC 培养基中，接种至新的 10 厘米培养皿中。

将饲养细胞置于细胞培养孵育箱中，使其贴附于培养板上30分钟。随后，收集悬浮的诱导多能干细胞（IPSCs），并通过70微米细胞筛过滤转导后的细胞，进行计数。将5 × 10⁵个IPSCs接种至含OP9培养基的新鲜饲养细胞培养板上，饲养细胞应处于80%至90%融合状态，且培养基中需添加小鼠Flt3配体（Murine-Flt3-Ligand），然后将培养物放回孵育箱中继续培养。

三天后，使用10毫升移液管用培养基冲洗培养皿。然后向培养皿中加入5毫升新鲜的OP9培养基，并通过小心而有力的移液操作轻轻冲洗掉任何半贴壁的iPSCs，注意不要破坏饲养层细胞。再用10毫升PBS重复冲洗一次，以收集剩余的半贴壁细胞，将每块培养皿中的冲洗液收集至一个对应的锥形管中，每份培养物使用一个锥形管。

离心收集细胞后，将细胞沉淀重悬于10毫升添加了小鼠Flt3配体（Murine-Flt3-Ligand）和IL-7的OP9培养基中，并通过70微米细胞筛过滤。将一个iPSC培养物接种至六孔板的每一孔中，每孔含有80%至90%融合度的饲养细胞单层，然后将共培养体系放回培养箱。每两天更换一半培养基，补充新鲜的添加小鼠Flt3配体和IL-7的OP9培养基；每四到六天根据需要将正在分化的iPSC重新接种至含有新鲜饲养细胞层的新培养板中。

首先用胰蛋白酶消化目标细胞培养物，将每种细胞类型重悬于 10 毫升新鲜培养基中。将每种细胞培养物接种至新的 10 厘米培养皿中，置于细胞培养孵育箱中使饲养层细胞贴壁。30 分钟后，收集悬浮的诱导多能干细胞（iPSCs），并将细胞悬液分别通过 70 微米细胞滤网，以去除细胞团块，随后进行细胞计数。

用预冷的PBS将每种培养物重悬于浓度为每毫升1.5 × 10⁷个细胞的溶液中，必要时再次过滤。然后，将4至6周龄的雌性C57BL/6小鼠逐只放入小动物固定器中，每只小鼠尾静脉注射200 µL一种类型的细胞。使用千分表卡尺测量双侧膝关节的肿胀程度，以建立基线值。

细胞转移后第10天，使用1毫升注射器将100微克甲基化BSA溶于完全弗氏佐剂中，在每只实验动物尾根部进行皮下注射。细胞转移后第17天，通过关节内注射的方式诱导关节炎：向每只经麻醉的过继转移动物的左膝关节注射含20微克甲基化BSA的10微升PBS溶液，向右膝关节注射含20微克甲基化BSA和100微克全卵白蛋白的10微升PBS溶液。诱导关节炎7天后，再次测量膝关节直径以计算膝关节直径的百分比增加，并手术切除髌骨。

用甲醛固定关节。然后经EDTA脱钙后，将膝关节包埋于石蜡中，并制备4微米切片用于组织化学染色与分析。第28天时，抗原特异性调节性T细胞表达高水平的CD3和抗原特异性T细胞受体。

这些细胞大多还表达 CD25、CD127 和 CTLA-4，这些分子通常在天然存在的调节性 T 细胞中高水平表达。事实上，通过细胞内染色检测发现，即使在体外长期使用 Notch 配体刺激后，诱导性多能干细胞（iPSC）来源的调节性 T 细胞仍持续表达 FoxP3。此外，当在体外用抗原致敏的脾细胞刺激时，这些抗原特异性的 iPSC 来源调节性 T 细胞能够产生抑制性细胞因子，表明这些细胞具有潜在的抑制表型。

在经OVA处理的膝关节中可观察到FoxP3阳性细胞，而在接受对照载体转导iPSCs的膝关节中则无明显FoxP3阳性细胞。此外，在接受TCR-FoxP3载体转导iPSCs的小鼠膝关节中，可见到更多CD4阳性、FoxP3阳性、TCRβ5阳性细胞，明显多于仅接受FoxP3载体转导iPSCs的小鼠，提示抗原特异性的iPSC-Treg细胞在过继转移后会迁移至抗原诱导的关节炎膝关节。当存在OVA时，iPSC来源细胞的过继转移还能显著减轻炎症性膝关节肿胀，但对注射对照甲基化BSA的膝关节无此效应。

通过高分辨率显微CT成像可进一步证实肿胀减轻的积极效果，与仅注射MBSA的对照组动物相比，经细胞移植治疗的膝关节中观察到的骨量丢失明显减少。一旦准备就绪，若操作得当，这些深入的实验步骤可在六周内完成。在实施该技术时，重要的是要记住诱导经TCR-FoxP3抗原转导的iPSCs发生特异性分化。

采用该方案后，还可考虑使用不同类型的抑制性细胞因子组合，以进一步探究抗原特异性诱导多能干细胞来源的调节性T细胞（iPSCs T reg cells）的存活能力及其功能特性。该技术建立后，为细胞治疗领域的研究人员探索抗原特异性调节性T细胞在自身免疫性疾病中的作用开辟了新途径。需要注意的是，操作直接来源于自体的生物因子具有极高危险性，因此在进行相关操作时，必须采取预防措施，例如在二级生物安全实验室中进行操作。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。