用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

本方案可使您获得大量具有功能性的抗原特异性T细胞，这是治疗自身免疫性疾病的一种理想且安全的方法。该技术的主要优势在于，它能够提供高效的转导过程，并产生大量具有功能性的T细胞。该技术可进一步拓展应用于治疗1型糖尿病及其他已知抗原的自身免疫性疾病。

此外，CAR T细胞可能对某些类型的癌症具有良好的治疗前景。该方法可用于生成表达其他CAR的免疫细胞。重要的是要掌握成熟可靠的技术，仔细阅读整个实验方案，并提前规划全部实验流程。

该为期两周的实验方案包含多个细分步骤，每一步的正确操作都对最终成功至关重要。本方法的可视化演示对于学习者准确掌握操作流程尤为关键。按照文中所述方法准备Phoenix细胞以进行转染。

建议标记培养板侧壁用于添加和移除培养基的位置，以尽量减少吹落细胞。第0天，吸除细胞的上清液，并用5 mL PBS洗涤细胞。沿培养板侧壁小心地逐滴加入7 mL低血清培养基，然后将细胞放回培养箱中继续培养。

向两个14毫米圆底聚丙烯管中各加入1.5毫升低血清培养基。向其中一个管中加入40微升转染试剂，向另一个管中加入15微克抗体重定向CAR质粒以及5微克包装质粒。室温孵育5分钟后，将转染试剂加入质粒管中。

轻轻吹打溶液三次使其混匀，并在室温下孵育至少20分钟。将3毫升混合液加入Phoenix细胞中，放入组织培养孵箱。4至5小时后，向细胞中加入1毫升FCS，并在37摄氏度下过夜培养。

第二天，移除细胞中的上清液，并加入四毫升新鲜预热的培养基。在第二天收集病毒，从 Phoenix 细胞中获取含有病毒的培养基，并通过过滤去除残留的细胞碎片。向病毒液中加入重组人 IL-2 储存液，使其终浓度为每毫升 200 国际单位，并立即用于转导。

向Phoenix细胞中加入4毫升新鲜培养基，放入培养箱中过夜。次日重复病毒收集，用于第二次转导，并弃去细胞。在接种小鼠CD8 T细胞前一日，向24孔板的每孔中加入1毫升抗小鼠CD3和CD28抗体的混合物，在4 °C下过夜孵育。

在第0天，取小鼠脾脏并置于细胞筛网上，将筛网浸入盛有10毫升PBS的细胞培养皿中，置于冰上。在细胞培养超净台内，将每只脾脏切成3至5块，用无菌注射器活塞将组织压过金属网筛。用1至4倍稀释的红细胞裂解缓冲液重悬脾细胞，以轻柔去除红细胞，在室温下孵育5分钟，然后取10微升细胞悬液与台盼蓝混合进行细胞计数。

以350 × g离心7分钟，沉淀其余细胞。使用小鼠CD8 T细胞分离试剂盒富集CD8 T细胞，并将细胞沉淀重悬于400 µL缓冲液中，每1×10⁸个细胞加入100 µL生物素标记抗体混合物。充分混匀细胞悬液，于4 °C孵育5分钟，使抗体结合。

然后每1×10⁸个细胞加入300 µL标记缓冲液和200 µL抗生物素微珠（Anti-Biotin MicroBeads），充分混匀，并在4°C下再孵育10分钟。同时，在分离器上安装分离柱，并用3 mL标记缓冲液冲洗分离柱。

将一个40微米的细胞筛置于柱子顶部，将一毫升珠子和细胞的混合物通过细胞筛进入分离柱中。收集流出液至预冷的15毫升离心管中，并根据制造商的说明洗涤柱子，将洗脱液收集到同一管中。计数细胞，并在350 × g离心5分钟以收集细胞。

用两毫升T细胞培养基洗涤，并再次离心。随后将细胞重悬于预热的T细胞培养基中，浓度为每毫升250,000至500,000个细胞。用一毫升无菌PBS洗涤预先包被CD3和CD28抗体的培养板，重复三次，然后每孔加入两毫升细胞悬液。

采用旋转混匀的方式将细胞均匀接种。作为对照，将相同数量的CD8 T细胞接种至一块未包被的孔板中的单个孔内，并在37°C、含10%二氧化碳的培养箱中培养48小时。第一天，通过向24孔板的孔中加入0.5毫升纤连蛋白片段，于4°C过夜孵育，制备人纤连蛋白片段包被的培养板。

第二天，移除纤连蛋白溶液，每孔加入一毫升 2% BSA 和 PBS。室温孵育 30 分钟，用一毫升无菌 PBS 洗涤处理过的孔。移除洗涤液后，该培养板即可使用。

使用台盼蓝计数活化的CD8 T细胞。通过离心收集细胞，并重悬于每毫升含五百万个活细胞的培养液中，用于转导。

向纤维连接蛋白包被板的每孔中加入100微升活化的CD8细胞悬液。然后加入1.5至2毫升预先制备的含病毒培养基，通过轻轻旋转混匀，使细胞均匀分布。将培养板密封于Ziploc袋中，在37摄氏度下以2,000 × g离心90分钟。

从离心机中取出培养板并转移至生物安全柜中。小心移除塑料袋，并确保培养板外部未被培养基污染。将培养板转移至37摄氏度的二氧化碳培养箱中。

四小时后，从每个孔中移除一毫升培养基，加入一毫升预热的完全T细胞培养基，并将培养板放回培养箱中。本实验方案的关键要点包括高滴度病毒、健康的活化T细胞以及适当的转导方法。细胞经PE标记的七号偶联抗CD8抗体、AF647偶联抗CD3抗体以及BV 421偶联抗CD28抗体共同染色，用于流式细胞术分析。

大约 70% 的 CD8 T 细胞共表达 GFP，表明 CAR 的表达。这些细胞同时也共表达 CD28 和 CD3。重要的是，所有检测中 GFP 阳性的细胞均与 I-Ag7 胰岛素 BR3 四聚体染色呈阳性，表明 CAR 在细胞表面表达，而与对照四聚体则无染色。

此外，分选后的实验组和对照组CAR T细胞仅在与表达相应配体的靶细胞共培养后，才分泌高水平的干扰素γ，这证实了转导细胞具有针对亲本抗体靶标的CD8效应T细胞表型。病毒产生细胞的转导、原代CD8 T细胞的分离以及这些T细胞的活化是本实验最重要的步骤。获得健康的活化T细胞，并使用适当的试剂对这些T细胞进行转导，是确保实验成功的关键。

该方法也可用于转导其他T细胞，但必须针对特定的T细胞类型进行优化。本方案为利用抗原特异性嵌合抗原受体T细胞疗法预防1型糖尿病奠定了基础。