使用温度控制的活细胞成像研究 D. discoideum 的蛋白质质量控制系统

该成像技术的总体目标是观察热应激诱导的盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）细胞内的细胞扰动。该方法有助于理解盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）中热应激反应及蛋白质质量控制的机制。该技术的主要优势在于能够对施加于细胞的温度进行严密且精确的控制，以实现活细胞成像。

开始实验前，按照文本方案中的说明准备盘基网柄菌细胞。成像前一天，将细胞分至低荧光培养基中，浓度为每毫升10,000个细胞。成像前，从组织培养板中用LFM收集细胞，然后将适量细胞转移至玻璃底培养皿中。

静置细胞20分钟，然后小心更换为新鲜培养基，以去除未贴壁的细胞。在23摄氏度的非应激条件下对细胞进行成像，至少采集六个视野。以1至0.25微米的步长采集最大深度为7微米的Z轴层扫图像，以获取细胞的完整三维体积信息。

然后获取明场参考图像，以评估细胞总数。接着，将冷却室的温度调节至30摄氏度。当温度显示达到目标值后，在明场通道中手动重新对焦。

在开始延时成像前检查所有已记录的视野，然后设置为期四小时的热胁迫延时成像，时间点之间的间隔为5至10分钟。在采集前两个时间点的过程中，检查并确保聚焦正确。热胁迫结束后，将温度降至23摄氏度。

等待温度显示调整完毕后手动重新对焦。然后在恢复阶段以10至20分钟的时间间隔连续记录8到10小时的延时影片。在采集第一个时间点时，需检查并确保对焦正确。

首先打开配备有 Cell Counter 插件的图像处理软件。通过点击“文件”，然后选择“打开”，加载明场图像序列。接着打开 Cell Counter 插件，点击“初始化”以加载图像序列。

通过单击相应的方框选择计数器类型。然后，对细胞总数进行计数，并通过单击“保存标记”来保存标记。标记保存后，加载荧光图像超堆栈的最大投影。

打开细胞计数插件，通过点击“加载标记”（Load Markers）来载入标记。接着，选择用于细胞质焦点的标记类型，并对细胞进行计数。现有标记可作为单个细胞位置的参考。

通过点击“结果”来获取每张切片的计数值，然后将计数值保存到其他位置以进行进一步计算。在本研究中，观察了GFP标记的多聚谷氨酰胺蛋白Q103在盘基网柄菌细胞中的分布情况。在正常生长条件下，Q103-GFP在细胞质中呈弥散分布。

在热应激条件下，Q103-GFP 标记物会聚集形成点状结构。当应激解除并在正常生长条件下继续培养时，这些结构逐渐消散。通过图像分析对 Q103-GFP 的重新分布以及热应激诱导的细胞质焦点的形成进行定量。

此处展示的是热应激反应的代表性结果。随着持续的热应激，细胞质中出现 Q103-GFP 焦点的细胞数量逐渐增加。在热应激过程中，蛋白质质量控制系统超负荷运转，因此易聚集的蛋白质无法维持在可溶状态。

热应激后，细胞质中出现焦点的细胞数量减少，表明聚集的蛋白质发生溶解。观看本视频后，您应能够充分了解如何监测热应激对盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）造成的扰动。在成像过程中，如果您的显微镜不具备硬件自动对焦功能，则务必始终注意确保焦距正确调整。

本方案中所示的温度控制方法可应用于热应激反应以外的领域。在正常生长条件下利用温度控制进行成像，可显著降低光毒性效应。