通过延时荧光显微镜在贴壁细胞培养中对蛋白质降解速率进行单细胞定量分析

本荧光成像方法的总体目标是利用SNAP标签在单个活细胞中测定目标蛋白的半衰期。细胞内蛋白质不断更新，其合成与降解速率因蛋白而异，并受到生理条件的调控。然而，目前常用的测定蛋白半衰期的方法，要么仅限于从大量细胞中获得群体平均值，要么需要使用蛋白质合成抑制剂。

在本视频中，我们演示了如何将 SNAP-标签与荧光延时显微镜相结合，用于测量活细胞中蛋白质的半衰期。该方法的优势在于能够实现单细胞分辨率，从而对培养细胞群体中半衰期的异质性提供估算。此处介绍的实验方案可应用于任何类型的贴壁培养细胞，只要其表达目标蛋白与 SNAP-标签的融合蛋白即可。

这可以通过内源性蛋白标记或过表达带标签蛋白来实现。SNAP-标签是DNA修复酶O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的一个突变体，可特异性地与苄基鸟嘌呤发生反应，而后者可与分子探针偶联。因此，任何SNAP-标签融合蛋白均可与一种荧光细胞通透性染料发生不可逆标记。

当洗去残留染料后，标记的蛋白质群体将呈指数衰减，由此可推断相应蛋白质的半衰期。在本视频中，我们使用胚胎干细胞，这类细胞在明胶包被的培养皿上进行经典培养时会形成紧密的克隆集落。为了使其以单层细胞形式生长，从而在荧光成像实验中实现单细胞分辨率，我们将细胞培养在降低细胞黏附性的包被培养板上，以减少由细胞质膜表面表达的细胞黏附分子介导的细胞间相互作用。

将重组Inc黏附蛋白用PBS稀释至每微升5纳克，然后在96孔成像板中每孔加入30微升稀释后的Inc黏附蛋白。避免反复吹打，因为重组Inc黏附蛋白非常脆弱。在37摄氏度孵育一个半小时。

吸去培养皿中残留的培养基，用 100 微升 PBS 洗涤一次，加入最多 200 微升预温的 ESL 培养基。使用表达目标蛋白与 SNAP-tag 融合蛋白的 ESL 细胞系。用 5 毫升 PBS 洗涤细胞。

然后加入 2 ml Tripson，37 摄氏度孵育 4 分钟。加入 4 ml ESL 培养基，重悬细胞，以 1000 ×g 离心 4 分钟。吸除上清液，用新鲜培养基重悬细胞，并进行细胞计数。

在经黏附涂层处理的成像板中，每平方厘米接种 30,000 个细胞。细胞接种后 24 小时进行 SNAP 染料染色。将细胞染料用 ELS 培养基稀释至先前确定的最佳浓度。

使用移液器吸去培养基，小心加入50微升稀释后的SNAP染料。在37摄氏度下孵育30分钟。吸去染料，并用200微升预温的PBS缓冲液洗涤三次。

加入 200 微升 ESL 培养基，于 37 摄氏度孵育 15 分钟。通过轻柔的移液操作进行洗涤步骤，不要使用自动吸液器，因为细胞容易脱落。重复上述洗涤步骤两次，然后加入 200 微升成像培养基。

使用不含酚红的培养基以减少荧光背景。使用可控制温度和 CO2 的显微镜。使用前将温度设置为 37 度，CO2 设置为 5%，并平衡 1 至 2 小时。

将培养板放入显微镜中，选择适合成像的区域。明场图像显示 ESL 以单层形式附着在包被的培养皿上。选择物镜，对于此类大小的 ESL，20X 物镜较为合适。

选择待记录的荧光通道的照明设置。调整激光功率和曝光时间以获得较强的信号，因为信号在成像过程中会逐渐减弱。设置延时实验的采集参数。

对于预期半衰期为2至20小时的蛋白质，选择12至24小时的采集时间，时间间隔为15分钟。启动成像实验。使用FIJI软件对视频进行处理和分析。

将获取的图像作为图像栈进行收集并进行形变处理。使用FIJI的“减去背景”功能去除图像栈中所有图片的背景。选择目标细胞，利用FIJI工具栏在其周围绘制感兴趣区域，并将该感兴趣区域添加至ROI管理器中。

进入下一帧并重复上述操作。在整个视频过程中持续追踪目标细胞，并为每个被追踪的细胞保存对应的感兴趣区域（ROI）。点击“测量”以获取ROI的平均荧光强度和面积数值。

为估算局部背景，在每个时间帧中，在目标细胞附近添加一个感兴趣区域。最后，单击“测量”以获取平均背景强度值。首先，通过将细胞感兴趣区域的平均强度值乘以其面积，计算细胞的平均强度。

然后，通过将背景感兴趣区域（ROI）的平均强度乘以细胞感兴趣区域（ROI）的面积，计算细胞的积分背景值。最后，为了获得细胞积分强度的背景校正值，需从细胞的积分强度值中减去积分背景强度值。为了得到细胞群体的平均半衰期，需将获得的数值归一化为每个细胞第一帧的强度值。

这确保了每个细胞对平均半衰期值的贡献权重相同，而与其绝对荧光强度无关。在细胞分裂后，分别追踪两个子细胞，并在扣除背景后对其积分强度求和，以考虑细胞分裂过程中的蛋白质稀释效应。保存两个子细胞的感兴趣区域（ROI）集合。

为了估算蛋白质的半衰期，使用 MATLAB 中的曲线拟合工具。蛋白质的降解遵循指数衰减规律，其中 F(x) 表示在给定时间点的荧光强度，a 表示初始强度，b 表示降解速率。从拟合结果中获得降解速率 b 的值后，可通过将 2 的对数除以 b 来计算半衰期。本视频展示了在多西环素不可用的 Opt4 SNAP-tag 融合细胞系中 SNAP 染料荧光的衰减过程。

观察到的荧光信号将取决于所用的细胞系、目标蛋白的表达水平以及所用染料的特性。对于蛋白降解实验，使用适当的SNAP染料浓度至关重要。该浓度应足够高，以确保在时间序列的初始阶段产生明亮的荧光信号。

然而，使用过高的染料浓度可能会导致即使在洗涤后仍有残留染料留在培养基中。游离染料可能在成像过程中与新合成的SNAP-tag分子结合，从而扭曲衰减曲线。因此，通过测试不同稀释度来优化SNAP染料浓度至关重要。

该图显示了在多西环素不可用细胞系上测试的八种不同浓度荧光 SNAP 染料的衰减曲线。根据制造商对活细胞成像的说明，选择初始染料浓度为 3 µM，并进行 1 比 3 的系列稀释，直至浓度达到 1.4 nM。在两个最高浓度下，信号未出现下降，而在较低浓度下，观察到的衰减呈指数曲线形式。

在此示例中，选择了 12 纳摩尔的最优浓度，因为该浓度可确保洗涤后培养基中残留的染料最少，同时荧光信号仍足够强，能够观察到清晰的衰减曲线。所述方案可估算与 SNAP 标签融合的任意给定蛋白质的细胞间变异性和半衰期。该图显示了三种不同无法使用多西环素的 SNAP 标签融合细胞系的单细胞衰减曲线及群体平均值。

Nanog和Oct4的半衰期相对较短，平均半衰期分别为2.9小时和4.8小时。而Srsf11的半衰期较长，平均为25.3小时。箱线图显示了这三种蛋白质半衰期的分布情况。

我们已证明，将 SNAP 标签与荧光延时显微镜结合使用，可测定任何目标蛋白的半衰期。单细胞衰变测量能够估算细胞群体中半衰期的异质性，而使用其他方法测定蛋白半衰期时则无法获得这一信息。使用 SNAP 标签监测蛋白降解时，最关键的步骤之一是确保洗涤后培养基或细胞内无残留的未结合染料。

否则，它可能会在实验后续阶段与新生成的SNAP-tag分子结合，从而影响衰减曲线的准确性。一方面，这需要仔细执行所有所述的洗涤步骤；另一方面，应尽可能降低SNAP染料的浓度，同时仍保持在能够获得良好信噪比的范围内。

应根据细胞系和所用染料的类型，针对每个实验优化SNAP染料的浓度。尽管在某些情况下SNAP标签可能改变候选蛋白的半衰期，但我们未观察到此类效应的证据，因为测定的候选蛋白半衰期与已发表的数值高度一致。为进一步排除SNAP标签对蛋白降解的影响，可选用的一种方法是：使用环己酰亚胺阻断蛋白合成，并在不同时间点进行免疫印迹检测，采用可识别内源性蛋白的抗体。

并直接比较SNAP标签候选蛋白与其无标签的内源版本的降解情况。