一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

本实验方案的总体目标是利用显微镜分析细菌生物膜在丝状菌丝上的形成过程。该方法有助于回答微生物学领域中的关键问题，例如细菌生物膜如何在菌丝上形成、其特异性如何，以及其组成成分是什么。该技术的主要优势在于，它能够在多个尺度上研究细菌生物膜在真菌菌丝上的形成过程，尺度范围从纳米级到厘米级。

本实验操作将由我实验室的 Cora Miquel Guennoc 和法国国家农业食品与环境研究院（INRA）PTEF 平台的电子显微镜工程师 Christophe Rose 演示。首先，准备与培养皿直径相同的玻璃纸膜，将其置于沸水中煮沸的 EDTA 中处理 30 分钟。随后用去离子水冲洗膜片，并进行两次高压灭菌处理。

为制备真菌预培养物，将真菌接种于琼脂培养基上，培养基表面覆盖经EDTA预处理的玻璃纸膜。在最适温度下培养，获得直径约一厘米的菌落。从预培养物中取材接种至含有EDTA处理玻璃纸膜的适宜琼脂培养基平板：用解剖刀轻轻刮取预培养菌落外缘区域，然后将菌丝转移至琼脂平板上。

将平板置于最适温度下培养，直至菌落直径达到约一厘米。准备细菌培养物（如 P.fluorescens BBc6）时，用无菌接种环从琼脂培养基上挑取两到三个单菌落，接种于 25 毫升 LB 培养基中，在最适温度下过夜培养。细菌过夜培养后，以 5,000 × g 离心 3 分钟。

然后将沉淀重悬于25毫升无菌的0.1摩尔磷酸钾缓冲液中。重复离心后，用相同的缓冲液将细菌浓度调整至每毫升10⁹个细胞。向六孔微孔板中每孔加入5毫升细菌悬液。

使用无菌剃须刀片将真菌培养物的玻璃纸膜切成小方块，每块膜上含一个菌落。然后用镊子小心地从固体培养基上取下带有菌丝的玻璃纸方块，并将其转移至细菌悬液的各个孔中。轻轻振荡微孔板，直至真菌菌落从玻璃纸上脱落。

然后移除玻璃纸片，使菌落保留在培养板中。根据所用菌株及待分析的发育阶段，在20摄氏度下以轻微振荡培养微孔板一定时间。对于P.fluorescens BBc6与RA L.bicolor，培养30分钟以获得早期生物膜，培养长达16小时以获得成熟生物膜。

为了去除浮游细菌以及通过静电作用附着在菌丝上的细菌，将真菌转移至装有高盐溶液的新六孔细胞培养板中进行冲洗。轻轻振荡培养板一分钟。随后将真菌转移至另一新六孔细胞培养板中，该培养板内含有5毫升无菌的0.1摩尔磷酸钾缓冲液。

轻轻振荡培养板两分钟，然后将真菌转移至新鲜缓冲液中。在保持真菌菌落处于缓冲液中的同时，使用解剖刀将菌落大致切成两半。将其中一半菌落转移至含有1毫升无菌水的培养皿中用于染色，并加入适量的荧光染料以观察真菌网络，例如与Alexa Fluor 633偶联的小麦胚芽凝集素。

然后将样品避光孵育。染色后，将样品转移至含有10毫升无菌0.1摩尔磷酸钾缓冲液的培养皿盖中，轻轻振荡一分钟进行漂洗。将载玻片一半浸入培养皿盖中，小心地将切片置于载玻片上方，使其漂浮。

然后缓慢地将载玻片从缓冲液中提起，使样品轻轻沉降在载玻片上。最精细的步骤是样品在载玻片上的定位。为避免生物膜变形，定位样品时必须将样品和载玻片保持浸没状态，并且在成像前不得再移动样品。

最后，向样品中加入10 µL抗荧光淬灭封片剂，并用玻璃盖玻片封片。使用10倍或40倍物镜的共聚焦激光显微镜观察载玻片。结合使用多视野拼接扫描（tile scan）和Z轴层扫（Z-stack）功能，获取真菌菌落及生物膜的全局三维图像。

进行电子显微镜观察时，先将真菌用高浓度盐溶液冲洗，之后将其转移至无菌水中，而非缓冲液中，以防止脱水过程中形成盐结晶。将生物膜转移至样品台，并去除多余的水分。随后，将样品转移至可变压力扫描电子显微镜的样品腔内。

在帕尔贴冷却台上将样品冷冻至零下50摄氏度，使其在扫描电镜腔室内直接缓慢冷冻干燥，设置100帕的可变压力并持续15小时。取出样品并转移至高真空薄膜沉积系统中，随后在氩等离子体条件下对样品镀上2纳米厚的铂层。

使用配备场发射枪和高分辨率腔内检测器、电子高压为1千伏的扫描电子显微镜观察涂层样品。该生物膜的介观尺度分析显示，荧光假单胞菌BBc6（绿色）在双色蜡蘑S238N菌丝（红色）上的生物膜分布具有异质性。该分析还可实现对生物膜形成过程的动态追踪，从早期仅有部分表达GFP标记的细菌附着于红色菌丝，到最终形成厚实成熟的生物膜，均可清晰观察。

如图所示，高分辨率的介观图像还被用于进行微观尺度分析，以获得菌落结构。此外，在该高分辨率下，三维共聚焦图像的二维最大强度投影中，使用 SYPRO Ruby 进行特异性标记（红色）显示了基质中蛋白质的存在，GFP 标记的 BBc6 细菌和 FUN-1 标记的真菌则呈深绿色。在对同一样品进行脱水和镀膜处理后，通过扫描电镜成像进一步获得了生物膜结构的更多细节。

绿色箭头指向生物膜中的细菌细胞，黄色箭头指向真菌菌丝。一旦掌握该技术，每个样本的实验操作时间约为两个半小时，不包括生物膜形成和微生物培养所需的孵育时间。在进行该实验时，需特别注意：该方法的成功在很大程度上取决于能否获得仅由少数几层菌丝组成的极薄真菌菌落。

完成此操作后，可采用其他方法（如诱变或原位杂交）回答更多问题，例如生物膜的功能或化学特性分析，或用于研究多物种生物膜。该技术建立后，为医学、环境科学、食品工业等多个领域的研究人员探索真菌-细菌相互作用过程中的生物膜形成提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何培养并分析细菌在真菌菌丝上形成生物膜的过程。