微生物菌落生物膜的石蜡包埋与显微切片技术用于显微分析

本实验的总体目标是制备石蜡包埋的生物膜切片，用于评估在完整天然形态结构中由荧光蛋白表达所报告的基因表达分布情况。该方法有助于回答微生物群落研究中的关键问题，例如特定基因在胞外多聚物合成过程中的表达如何在天然生物膜结构背景下分布。该技术的主要优势在于，可在保持生物膜横截面形态完整的基础上进行基因表达分析，同时适用于后续处理步骤，如对特定结构进行染色以及共聚焦显微镜或电子显微镜等高分辨率成像。

根据文本方案配制胰蛋白胨琼脂溶液后，使用50毫升锥形管将45毫升溶液倒入100毫米×100毫米的方形培养皿中。让琼脂凝固约20至30分钟。在第一层上方再倒入第二层15毫米厚的琼脂溶液，然后静置过夜使其完全凝固；如有必要，可使用无绒布擦拭皿盖上的冷凝水。

接下来，为了观察菌落生物膜，根据文本方案从冻存菌种中培养出单一的铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa）单菌落后，用移液器将 2.5 至 10 微升的菌悬液点样到双层培养基平板上。菌落可在 25 摄氏度、相对湿度 80% 至 100% 的黑暗条件下培养最多四天。随后，轻轻将 15 毫升琼脂溶液倒入生长培养基及菌落表面，在室温下静置 5 分钟，使琼脂形成凝胶。

然后，使用锋利的剃刀刀片切割出一个方形的三层样品台，使菌落夹在最上面两层之间。如果准备多个样品，应确保每个样品台切割成相近的尺寸。轻轻去除含有菌落的样品台中多余的琼脂。

然后，将刮刀的平头浸入 PBS 或水中，轻轻插入琼脂的上层与下层之间。立即将分层的菌落转移至用耐化学标记笔标记的包埋盒中。将包埋盒放入装有预先配制好的固定液的玻片邮寄盒中。

处理样品。使用1× PBS 每次一小时，清洗两次。为获得最佳效果，使用自动组织处理仪的旋转功能低速设置，以实现试剂的均匀混合。

为包埋样本，将熔化的石蜡（加热至 55 摄氏度）倒入石蜡模具中，然后使用预热的扁平刮刀迅速将浸润过的样本块从包埋盒转移至石蜡模具内，确保样本块与模具底部保持平行。在 4 摄氏度下静置过夜，使石蜡完全凝固。包埋于固体石蜡中的样本可在该温度下长期保存。

待石蜡完全凝固后，将样本从模具中取出，并用剃刀片修去样本周围的多余石蜡。保留一端延伸出的部分石蜡，以便将其夹入切片机中。修块时应使包埋在石蜡中的样本呈适当形状，以利于切出平整连续的带状切片。

修块过程中的微小瑕疵可能会在切带中产生伪影，并破坏切片的完整性。接下来，将水浴锅加热至42摄氏度。然后，将样品夹紧在切片机上，使菌落表面与刀刃边缘垂直。

以50微米为间隔修整样品，直至到达目标菌落平面，然后使用切片速度为75至80 RPM、 clearance angle（ clearance angle）为6至10度的切片机进行切片。切出所需数量的厚度为10微米的切片带。随后，用细尖画笔将切片带从刀片上轻轻剥离。

现在，使用镊子或巴斯德移液管尖端的一滴水，轻轻地将切片带转移至水浴中。立即将载玻片插入水浴，并以45度角置于切片带下方。将切片带的窄边轻轻接触载玻片上磨砂标签下方的位置。

切片应紧贴载玻片。将载玻片从水浴中取出，调整角度使其与水面垂直，使切片带沿载玻片长度方向平展贴附。避免在切片带下方滞留过多水分。

将切片轻轻立于吸水无绒纸巾上，吸去多余的水分。然后将切片平放在纸巾上，置于暗处室温下过夜干燥。将水平的加热板预热至45摄氏度，将切片放置于加热板上，加热30至60分钟。

石蜡将变为半熔融状态并紧贴载玻片。轻轻将载玻片从加热板上取下，平放在光滑、水平、室温的表面上，静置约一分钟，直至石蜡完全凝固。确保熔融的石蜡不会向载玻片的任一侧拉扯。

将样本置于玻璃载玻片盒中，使用透明剂分四次清洗，每次五分钟。每次清洗之间用布氏抽滤器去除溶液。再用100%乙醇清洗载玻片三次，每次一分钟。

然后，根据文本方案对切片进行复水后，立即用三羟甲基氨基甲烷缓冲封片剂封片，并加盖盖玻片。切片周围的覆盖琼脂不与固定剂发生反应，因此不会黏附在载玻片上。该琼脂在复水过程中可能脱落，从而损伤切片，因此在复水过程中应避免搅动溶液。

将封片剂在室温下静置过夜，使其充分聚合。聚合完成后，用透明指甲油将盖玻片封固于载玻片上。最后，将密封好的载玻片置于4°C黑暗环境中长期保存。

尽管使用40倍油镜进行微分干涉差（DIC）成像足以显示生物膜薄切片的某些形态特征，但通过基因工程改造为持续表达荧光蛋白的菌株进行荧光显微镜观察，可更清晰地呈现样品中细胞的分布情况。如本图各面板所示，单个切片的图像可拼接成整个菌落的横截面，从而在宏观层面为结构特征的定位提供形态学背景。利用经基因工程改造、可在特定启动子调控下表达荧光蛋白的菌株，能够实现对基因表达分布的可视化观察。

此外，可在含有染料的培养基上培养菌落，或在切片后添加染料以特异性染色多糖。最后，样品也可采用透射电子显微镜进行更高分辨率的制备与成像，如本文所示。在进行该操作时，需特别注意样品的脆弱性，以及在固定、切片或再水化过程中可能引入的荧光和结构伪影，这些因素可能会影响对数据的解读。

该方法可实现定量图像分析，例如将荧光报告基因的表达谱与生物膜的形态特征及Z轴结构进行关联分析。本方案可应用于多种具有医学和工业意义的成膜微生物，如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养和制备菌落生物膜，并通过石蜡包埋进行切片前处理。