使用快速纳米定位系统从单分子FRET实验中获取结构信息

快速纳米定位系统（Fast Nano-positioning system）的总体目标是通过将单分子FRET实验与严格的统计分析相结合，实时提供生物大分子的结构信息。该方法能够回答结构生物学领域中的一些关键问题，例如在标准结构生物学工具无法应用的情况下，确定大分子中柔性结构域的定位。与其它基于FRET的结构分析工具相比，快速NPS的主要改进在于：不仅可以利用最可能的位置，还可借助三维概率分布来比较不同的染料模型。

该技术的主要优势在于，它将蛋白质数据库中的结构数据与定量的单分子荧光测量相结合。开始实验前，组装一个流动池和样品架。准备进样和出样螺钉时，将硅胶管插入中空标签螺钉中，并用剃刀刀片将管子两端剪成平直切口。

将盖板螺丝拧入样品支架。将流动池的石英载玻片孔与样品支架的螺纹对齐。轻轻拧紧玻璃固定夹的螺丝，以固定流动池的位置。

将20厘米长的硅胶管插入进样口和出样口的螺钉中。用500微升PBS清洗流式腔室。然后用100微升含中性亲和素的PBS溶液冲洗流式腔室，确保进样口管末端形成液滴，以防止空气进入样品室。

每次操作后夹闭进出口管路，以防止空气进入流动室。室温孵育15分钟。随后用500微升PBS洗去中性亲和素溶液。

在棱镜上滴加一滴浸油，然后将棱镜拧紧到样品室上。使用全内反射荧光显微镜采集单分子FRET数据。启动相机软件和载物台压电马达软件。

将腔室水平安装在TIRF显微镜的微米级载物台上，尽可能保持平直，并确保其与所有三束激光相交。加入浸油液体，通过观察红外反射来调节显微镜物镜的焦距。设置相机参数、文件路径以及自动递增参数。

启动实时相机成像，并使用全部三种激光器以最大强度漂白背景荧光。随后降低激光强度。然后，向腔室中加入100微升荧光微球溶液。

等待10分钟，使磁珠结合到腔室表面。录制一个视野范围内包含50至100个磁珠的视频，并使用较高的峰值检测阈值进行批量分析。加载视频文件，选择视野对角两个角落中具有明显中心的两个磁珠。

选择这些微珠中强度最大的像素。取下棱镜并进行清洁。准备第二个样品室，并将棱镜支架旋紧到样品室上。

将样品室安装到千分尺载物台上。然后，向样品室中加入100微升浓度为50至100皮摩尔的生物素化荧光标记样品溶液。等待分子与样品室表面结合。

同时点击“采集信号”开始录制，并打开供体激发激光。调节激光功率，确保视野中至少80%的分子被漂白。然后移动样品腔，显示一个未漂白的区域，并录制下一个视频。以这种方式逐次漂白样品腔的其余部分。

在TIRF显微镜上完成测量后，需要对获得的单分子FRET数据进行分析以得到平均FRET效率。对样品的供体和受体视频进行批量分析，然后将批量处理后的视频文件加载到数据分析软件中。

单击“未选中”按钮以标记各个FRET相位。依次单击FRET时段的起始点、受体荧光强度因漂白而下降的时间点，以及供体荧光强度因漂白而下降的时间点。在下一个窗口中，选择“是”以保留所选的FRET效率轨迹。

当每个分子均完成分析后，保存轨迹并分析下一个视频。分析完成后，运行脚本以合并FRET结果。使用默认输入选项将合并后的逐帧FRET文件导入数据分析软件中。

将数据绘制成直方图，并使用非线性曲线拟合工具拟合高斯曲线。超出值即为主要的FRET效率。使用紫外-可见光谱和荧光光谱法测定每种染料的各向同性Forster半径以及稳态各向异性值。

纳米定位系统的设计灵感来自广为人知的全球定位系统（GPS），我们通过若干已知位置（卫星）来确定一个未知位置（天线）。开始NPS分析时，启动FastNPS软件并创建一个新的任务文件。在ModelDyePrior窗口中，输入待定义位置的空间分辨率，以设定标记天线和卫星的位置先验信息。

通过加载相应的居中PDB文件来排除大分子内部区域。输入染料直径和骨架化距离。填写染料可能位置的最小和最大坐标值。

如果所定义的位置是一个卫星分子，选择通过柔性连接臂连接染料，并输入来自居中PDB文件的原子坐标。填写连接臂的长度和直径。点击计算可及体积，保存之前的位置，并导出用于可视化。

对所有卫星和天线重复此过程。位置定义完成后，打开“定义测量”窗口，创建一个新的染料分子，并加载此前与该染料相关联的位置。

输入荧光各向异性值，选择合适的染料模型，并激活该染料。重复此过程，直至所有染料均已定义。然后，创建新的测量。

从已定义的染料中选择一个FRET配对。输入该染料对的单分子FRET效率及其误差，以及各向同性的Forster半径，然后启动测量。对所有染料对重复此操作。

接下来，打开计算窗口。如果已为不同染料指定了不同的模型，请选择“用户自定义”。否则，请选择适用于所有染料的模型。

执行计算并打开结果窗口。使用 FastNPS 时，必须记住针对所有染料调整模型，以尽量减少可信体积，同时确保一致性。如果一致性低于 90%，请单击详细一致性，找出在一致性低于 90% 的条目中共同存在的染料。

打开“定义测量”窗口，更改相关染料的模型。以“用户自定义”模式重新运行计算。可单独或批量导出染料的可信体积。

在可视化软件中打开密度文件，并将置信度调整至所需水平。通过单分子FRET效率测量了未知天线分子与古菌RNA聚合酶开放启动子复合物内多个已知卫星分子之间的距离。对该数据进行NPS分析，确定了这些染料分子相对于古菌RNA聚合酶开放启动子复合物的可信体积。

使用了五种不同的模型对染料分子进行分析，并比较了结果。当采用假设染料只能在未知取向的圆锥范围内自由旋转的模型进行计算时，可信体积与实测数据一致。其中，经典模型尤为保守，因为它进一步假设染料处于固定位置。

这会产生一个相对较大的可信体积，但该体积通常能够包含正确的位置。更高精度的模型假设染料在其荧光寿命内可以完全自由旋转。iso 模型与经典模型类似，均假设染料在可及体积内处于固定位置。

meanpos-iso 模型假设对所有可能的位置进行动态平均。尽管 iso 模型的可信体积远小于非 iso 模型计算出的体积，但其结果与实测数据不一致。我们希望开发一种技术，能够捕捉瞬态复合物的动态结构信息，这一问题目前尚无法通过现有的结构分析工具解决。

单分子FRET数据记录完成后，FastNPS分析可在数小时内完成，从而快速比较不同的染料模型。通过此流程，后续可进一步开展分子动力学（MD）模拟等其他方法，以获得与实验单分子FRET数据一致的结构模型。