使用峰值力定量纳米力学性能成像对红光光感受器进行原子力显微镜观察

本实验的总体目标是利用原子力显微镜获取感光蛋白的高分辨率图像。首先获取感光蛋白样品并进行稀释。第二步是将蛋白样品滴加到新鲜解理且洁净的云母表面，孵育约30秒。

然后用缓冲液冲洗MICA，以去除未结合和松散附着的分子。接着，将样品连接到配备有适当探针的液体池上。将此组装体装载到扫描仪上。

在用缓冲溶液填充液体池后，将探针与样品接触并开始扫描。最终，结合峰值力的原子力显微镜通过定量纳米力学性能成像，用于获取样品表面单个光感受器蛋白的图像。

结合峰值力 q 和 m 的原子力显微镜能够回答分子生物学领域中的关键问题，例如哪些重要的结构和化学特征决定了生物活性大分子的功能。与核磁共振（NMR）和X射线晶体学等现有方法相比，该技术的主要优势在于可在具有生物学相关性的环境中获得完整蛋白质及其他生物大分子的高分辨率图像。通常，初次使用该方法的研究人员会面临困难，因为探针和溶液的调谐需要多个步骤，其中一些步骤相当复杂。

借助峰值力 q 和 m 以及自动化软件，其中多个步骤得以简化，从而为新用户和本科生提供了极大的便利。本次实验操作将由我研究实验室的三名本科生进行演示：Marie Kroger、Blair Sorenson 和 Jessica Thomas。这三名学生将在今年开始攻读微生物学、化学工程和化学领域的研究生学位。

这些设备必须按特定顺序开启：首先开启计算机，然后是控制器，最后是光纤光源。显微镜需要读取 FM 和 LF fm 信号。

必须在软件中将相机置于 FM 光学头的正上方。应选择以下选项。实验类别为力学性能。

实验组为定量纳米力学映射，实验模式为液体中的峰值力轻敲模式（peak force q and m）。在正确选择设置参数后，即可加载并配置实验。应首先使用Z轴物镜调节相机焦距，然后利用粗调控制装置移动载物台，目标是将原子力显微镜（AFM）探头孔径置于载物台表面前方一毫米处，以便使用圆盘状夹持镊子操作新鲜裂解的云母表面样品。

首先使用完全清洁的部件组装流体池。先将软管接头连接到洁净流体池的端口上。然后使用平头镊子非常轻柔地将O形圈压入流体池上的凹槽内。

接下来，在探针固定夹上轻轻按压弹簧，并将其从凹槽处转开。使用同一把镊子夹住探针，将其滑入凹槽中，使探针尖端朝向细胞中心。然后用固定夹将探针固定。

下一步是检查 A FM 上的夹具，必须确保其完全缩回。将组件朝下放置在样品表面，然后将其套在 A FM 的固定螺柱上以实现稳定固定。

降低夹具。为检查O形圈，按下显微镜上的向下开关，直至看到O形圈。此时O形圈应被牢固地压在支撑盘与液体池之间。

可以使用粗调旋钮将流体池调至焦点。接下来，利用XY调节装置对准探针尖端。探针尖端看起来像一个金属金色的三角形。

现在使用压电下移杠杆，将探针尖端移近样品表面，调整焦点对准探针尖端、反射面，并监测悬臂相对于该反射面的位置。目前，它们应已紧密对齐，但尚未完全重叠。接下来，准备注射器。

加入一毫升缓冲液并连接适配器。然后将注射器连接到喷射软管上，并完全推出活塞。接下来，使用适配器将软管连接至流体池以填充腔室，轻轻按压活塞，直至腔室中心充满液体。

流体池中不应存在任何气泡，且液体不得溢出到显微镜上。然后将注射器置于腔室上方一个稳固的位置。接下来，使用摄像头画面和 XY 平移旋钮进行调节。

为了在屏幕上找到激光位置，应看到一个弥散的红点。找到后，使用激光控制将其移动至探针处。最后，调节激光和镜面控制，使显微镜上的和信号最大化至四到六之间，并调节四象限光电二极管。

接下来，使用扫描头上的旋钮调节垂直和水平偏转，直到显微镜上的数值尽可能接近零。在继续操作前，务必选择合适的采集选项。在“每行样本”窗口中将扫描速率设置为约一赫兹。

输入 256。用于扫描辅助自动控制。在扫描辅助自动 Z 限位中选择“单个”，然后选择“关闭”。

Z轴限制应为500纳米，扫描尺寸应为1微米。正确设置参数后，对探针进行校准。当探针尖端接近表面时，观察Z轴压电电压的变化。

如果探针尖端超出范围，需撤回并重新接近，此时可能需要更换探针尖端。如果此操作无效，当探针尖端接触时，各采集窗口中应出现线条，这些线条将构成图像。开始对云母表面进行连续图像采集。

缓慢放大以确保 MICA 表面平整且洁净。准备一个四室培养皿，并加入冷藏的成像缓冲液，每个腔室至少需要五毫升。

在取稀释后的蛋白样品前，先用微量移液器轻轻搅拌。然后取200微升的样品，将其加到MICA表面。等待约30秒，使溶液在表面停留。

然后使用圆盘夹具将圆盘提起，保持水平不倾斜，并立即浸入第一池缓冲液中。保持一秒钟，确保圆盘始终与实验台平行。在清洗步骤中，保持样品与培养皿平行非常重要。

这些柔软且具有柔韧性的分子在水溶液的强流作用下，其表面可能发生形变。接下来，将圆盘依次短暂浸入其余三个溶液池中，每个池子浸泡一秒钟。然后将圆盘转移至一块干燥无尘的布上。

让多余的水分转移到布上，但不要让圆盘完全干燥。切勿让布接触样品。使用圆盘夹具小心地将样品从布上取下，并将样品放置到原子力显微镜（AFM）扫描仪上。将液体池置于样品上方，然后进行后续的设置和成像操作。

在正确设置探针的所有参数、弹簧尺寸和针尖半径后，像成像时一样对探针进行校准。Micah，在探针接近表面时观察ZP azo。

拍摄图像时，让扫描仪对同一区域至少连续扫描两次。使用连续捕获模式保存每幅图像。根据需要调整图像大小和位置。

当自动软件完成特定图像尺寸的扫描参数调整后，关闭软件以进行精细调节。手动调节图像的焦距、扫描速率、Z轴限定、扫描线数以及设定点。

如果图像变得过于模糊，请重新打开软件以返回至原始起始位置。在放大蛋白质图像时，应降低扫描速率，并相应增加扫描线数，以提高图像分辨率。后续分析图像时，首先单击平整图标对图像进行平整处理。

选择零阶项并执行操作。有时需要使用平面拟合以获得适当平坦的图像。选择平面拟合图标，并使用光标在图像的平坦区域上绘制一个平面。

执行普通拟合，并根据需要重复操作。接下来，选择横截面标签以测量蛋白质的尺寸。使用光标在待分析的分子或区域上画一条线。

在多个区域重复此过程。如果需要叠加图像，可使用荧光显微镜研究任意数量的生物分子。对于处于光适应状态的光感受器蛋白，新鲜裂解的云母基底是适合蛋白质吸附的平整表面。采用峰值力定量纳米力学模式可观察到单个光感受器蛋白二聚体。

箭头指出单个二聚体，星号表示使用图像分析软件识别的蛋白质聚集体。在图像展平后，可测量蛋白质的横截面。XY 数据与高度测量值相关。

这些可用于多种计算。观看本视频后，您应能够设置一个原子力显微镜实验，以在生物学相关的环境中收集表面蛋白质的高分辨率图像。掌握该技术后，大约可在三到四小时内完成实验。

因此，峰值力轻敲模式（peak force qNM）是原子力显微镜的一种适宜形式，可引入到参加仪器分析、生物化学和现代物理学等实验课程的本科生教学中。该方法问世后，为扫描探针显微镜领域的研究人员探索蛋白质、核酸甚至活细胞等生物分子在生物相关介质中的特性开辟了道路。