一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

本研究的总体目标是描述一种新型的视网膜下注射技术，可用于将病毒载体、药理学试剂或诱导性多能干细胞靶向递送至小鼠的视网膜下腔。该方法可解答视觉科学与眼科学领域中的关键问题，例如评估针对视网膜变性疾病的新型治疗干预措施的有效性。该技术的主要优势在于，能够以高效率、最小损伤以及视网膜结构与功能快速恢复的特点，将物质递送至视网膜下腔。

本实验操作将由我实验室的技术员 Sachin P 演示。开始操作前，修剪麻醉小鼠的胡须以方便观察，并使用循环水垫将动物体温维持在 37 摄氏度。接着，用 2.5% 去氧肾上腺素滴眼液散大其瞳孔。

然后，使用甲基纤维素滴眼液以防止角膜干燥，并尽量减少麻醉引起的暂时性白内障。手术前对器械进行灭菌。随后，在生物安全柜中配制稀释的荧光素溶液。

用注射器吸取适量荧光素。接着，进行足趾挤压以确认动物已处于深度麻醉状态，并将小鼠摆位，使待注射的眼睛朝上且在解剖显微镜下清晰可见。用一对尖头镊子轻轻夹住颞侧结膜。

然后，使用弯头Vannas剪刀做大约90度的环形切口。在下方的Tenon囊上重复此操作。接着，用尖头镊子切除周围结缔组织，同时将眼球向鼻侧旋转。

操作时应朝向注射部位进行，位置大约距离视神经0.5毫米，并需格外小心以避免损伤眶后静脉窦。关键步骤是暴露注射部位，这需要旋转眼球，同时不得损伤眼球本身或相关结构，尤其要避免损伤眶内血囊。在本操作中，使用22.5度眼科刀轻轻刮擦眼杯的巩膜部位，以在注射部位做一小切口。

切口应足够小，仅能使针尖通过巩膜即可。接着，将33号斜面针头插入巩膜切口，斜面朝向并平行于视网膜。通过缓慢而均匀地按压推动器，注入所需量的0.01%荧光素。

请注意，当针头位于视网膜下腔时，按压注射器推杆会感到轻微阻力。若针头刺穿视网膜，则无阻力感；若针头未穿透巩膜或视网膜色素上皮（RPE），则会感到较大阻力。另一个关键步骤是准确将注射靶向视网膜下腔。

操作时必须避免穿透神经感觉层视网膜进入玻璃体腔。拔出针头前应等待数秒，以尽量减少反流。随后用无菌生理盐水冲洗眼睛，并确保眼球已转回正常位置。

然后，在注射眼的角膜表面涂抹一层厚厚的三重抗生素眼膏。之后，将小鼠放入清洁的单独笼子中恢复。在麻醉恢复期间监测其呼吸和体温，并确认其能够维持胸卧位。

进行额外的适当术后监测和治疗，包括皮下注射卡洛芬，以进行术后疼痛管理。此处显示的是注射部位穹窿状隆起的三维重建图像。该穹窿状隆起以密集的白色填充，以显示视网膜脱离的范围和边界。

在OCT图像中，视网膜的横截面呈白色，而视网膜色素上皮层（RPE）和光感受器层水平的液体填充区域则呈黑色。本图展示了注射前、注射后10分钟及注射后四周，在视网膜脱离最显著部位的代表性OCTB扫描图像。该图像显示了由0.3 µL注射所形成的平坦水泡（bleb）的形成与消退过程。

此图像显示了由0.5微升注射引起的穹顶状水疱的形成与消退过程，而此图像则显示了由1微升注射引起的穹顶状水疱的形成与消退过程。最后，此处为注射部位出现严重脉络膜瘢痕化和视网膜变薄的示例。水疱消退后，视网膜仍保持正常功能。

在九种光照强度下，显示了注射前和注射后四周的暗视杆细胞介导反应的波形，注射体积分别为 0.3 微升、0.5 微升和 1 微升。一旦掌握，该技术每只眼睛可在 10 至 15 分钟内完成。在进行该操作时，重要的是在开始前评估眼睛的健康状况。

排除存在角膜或晶状体混浊，或因眼球深陷而使该操作极为困难的眼睛。完成此操作后，可进行其他方法，如光学相干断层扫描（OCT）和眼底成像，以评估注射质量。