视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

我的研究聚焦于开发基于干细胞的疗法，用于治疗导致感光细胞退化的晚期视网膜疾病。我们研究的目标是利用临床安全且具有功能的感光细胞前体细胞替代患者体内丢失的感光细胞，以期改善其视力，甚至恢复视觉功能。主要的临床前研究模型为小鼠。

但由于其眼球体积小，使得注射材料变得困难，尤其是在视网膜下注射时。掌握成功进行视网膜下注射的技术需要耐心和毅力。我们已成功开发出一种基于层粘连蛋白的受体分化方法，可在32天内生成光感受器前体细胞。

在啮齿类动物中，将这种光感受器前体细胞悬液进行视网膜下移植，可在眼内宿主细胞与移植物之间形成突触连接。这已实现部分视觉功能的恢复。我们的方法十分简便。

直接可视化有助于外科医生将针头引导至目标区域。首先将PRDM置于37摄氏度的水浴中。从液氮中取出一支含有第32天人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞的冻存管，并将其置于干冰上保存。

然后将冻存管在37摄氏度水浴中解冻三到五分钟。用一毫升PRDM重悬细胞。在130×g离心四分钟。

去除上清液后，将沉淀物重悬于1毫升PRDM中。细胞计数时，取10微升细胞悬液，按制造商说明书与0.2%台盼蓝混合。用移液器将细胞混合液加入细胞计数板载玻片中。

使用自动细胞计数仪测定细胞数量和活率。若细胞活率高于70%，则将剩余的细胞悬液在130g条件下离心4分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于PRDM中用于移植。

使用10微升移液枪头，将微型离心管中的细胞团块重悬，直至肉眼不可见团块。将细胞悬液转移至33号注射针筒中，并确认细胞溶液可从针头顺利挤出。开始操作前，取一只麻醉小鼠，在其眼部滴加一滴1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素，以扩大瞳孔。

然后将眼用凝胶涂抹于角膜，以防止干燥及麻醉引起的白内障。接下来，在无菌环境中架设直立式手术显微镜并调整为直射光路，以进行视网膜下注射。准备10微升玻璃注射器时，先取下针座，再安装33号钝针头。

取下金属帽盖，将针头牢固地安装到注射器上。用蒸馏水冲洗针头，以检测是否泄漏及针头是否通畅。然后排空注射器，并小心放置一旁备用。

接下来，将麻醉后的小鼠置于垫子上，并使治疗眼朝向显微镜物镜。滴加0.5%盐酸丙帕卡因，等待30秒。然后向眼部加入150 µL眼用凝胶，并贴上圆形盖玻片。

进行初步的眼部检查，观察角膜、虹膜、瞳孔、晶状体和结膜。调节焦平面，通过瞳孔观察小鼠眼底。然后调整头部位置，使视神经乳头与瞳孔中心对齐。

随后，轻敲含有hESC来源的光感受器前体细胞的试管底部，以获得均匀的细胞悬液。使用带有33号钝头针头的10微升玻璃微量注射器，吸取2微升细胞混合物。用30号一次性针头在距角膜缘后方2毫米处制造巩膜切口。

保持针头与角膜约呈45度角，以避免接触晶状体。当针尖在眼内可见时，小心地回撤针头。将使用过的针头丢弃至锐器盒中，以防止针刺伤。

现在，取玻璃注射器，将钝针插入巩膜切除伤口。推进钝针时避免接触晶状体，直至到达入口伤口对侧的视网膜。轻柔穿刺视网膜，直至观察到巩膜上出现压力分支。

然后在保持注射器轻柔压力的同时，向视网膜下腔注射两微升细胞悬液或PRDM培养基。可见泡状隆起的形成表明注射成功。等待10秒，使细胞沉降。

轻柔地将针头从眼球撤出。为观察滤泡，移动小鼠头部使眼睛位于显微镜下，并通过轻握头部固定位置。对于术中光学相干断层扫描，使用手术显微镜上的 iOCT 功能，并在 OCT 屏幕上选择“cube”模式。

通过按压箭头按钮将扫描区域定位在滤泡上。为优化OCT图像质量，调整居中位置和焦点。按下捕获或扫描按钮以获取滤泡区域的OCT扫描图像。

然后查看图像以检查扫描质量。最后，移除盖玻片，并用纱布轻轻清洁眼内的凝胶。注射后给予一次抗生素软膏以预防感染。

OCT扫描显示，在经细胞处理的眼中，人胚胎干细胞（HESC）清晰可见，悬浮于视网膜下腔内。相比之下，经培养基处理的眼中则显示清晰透明的液体，视网膜下腔内无细胞存在。