经头孢哌酮处理的临床相关小鼠模型 艰难梭菌 菌株 R20291

本方案的总体目标是提供一种分步实施头孢哌酮小鼠艰难梭菌感染模型的指南，重点强调感染后临床疾病的监测、细菌计数、毒素细胞毒性以及组织病理学变化。该详细方案将帮助研究人员准确建立艰难梭菌感染的小鼠模型，这对于研究该细菌的致病机制以及评估新型治疗方法至关重要。使用该小鼠模型的主要优势在于，仅需让小鼠接触一种抗生素五天，即可使其易于被艰难梭菌定植，并表现出与人类疾病相似的持续性临床病程。

首先，取所需的目标产气荚膜梭菌（C.difficile）标准菌株并涡旋混匀。在超净工作台中，将该菌株用无菌水在带螺帽的试管中稀释，使浓度达到每25微升含10⁵个孢子。将此混合液标记为孢子接种物，并将试管置于65摄氏度水浴中加热20分钟。

接下来，在超净工作台中，用移液器将50微升加热后的孢子接种物转移至无菌微量离心管中，并将其放入厌氧室中备用。将剩余的孢子接种物装入连接无菌球状头胃饲针头的1毫升注射器中。在超净工作台中，取一只实验小鼠，通过轻轻抓住其颈部和背部的松弛皮肤来固定头部。

用食指固定小鼠头部，确保动物不发声或表现出痛苦迹象，进一步固定其头部并拉长食道。保持小鼠直立、垂直的姿势，轻轻将灌胃针从口腔侧方插入。沿小鼠口腔顶部引导灌胃针，并缓慢推进至食道内。

当针头插入食管约一半深度时，注射25 µL孢子接种物，然后轻柔地撤出针头。将动物放回笼中，观察其是否有咳嗽或呼吸困难等可能提示意外气管给药的迹象。接下来，取此前在厌氧环境中保存的孢子接种物等分试样以及剩余的灌胃用孢子接种物，分别用180 µL 1×PBS进行10倍系列稀释，稀释梯度为1至10。

进行四到五次此类稀释。采用无菌技术，将每种连续稀释液各100 µL分别转移至单独的TCCFA平板中。每次使用新的无菌L形涂布棒，将稀释的接种物均匀涂布于每个平板表面。

将平板置于37摄氏度的厌氧条件下孵育24小时。最后，计数每个稀释平板上的艰难梭菌菌落，并计算菌落形成单位，以确定给予小鼠的感染剂量。为评估目的采集小鼠粪便样本时，首先用手指轻轻但牢固地捏住小鼠颈部和背部的松弛皮肤以固定动物，确保小鼠未感到不适。

用小指轻轻抬起动物的尾巴，暴露肛门。将一支已知重量的无菌微量离心管直接置于动物肛门下方，确保管子不直接接触小鼠。当动物排便时，将粪便颗粒收集到管中。

将试管在室温下保存，直至收集完所有必要样本。使用分析天平称量装有粪便的试管，并将质量记录至小数点后四位。通过减去试管重量，计算粪便颗粒的重量。

接下来，将内容物进行1:10稀释，并重悬于1×PBS中。用移液器枪头轻轻搅动，使粪便物质充分分散到溶液中。将样品在室温下孵育30分钟，使内容物自然沉降。

在厌氧条件下保存溶液，用1x PBS对每个样品进行连续稀释。将每种连续稀释液各100微升转移至TCCFA平板。使用无菌的L形涂布棒将菌液均匀涂布于平板表面。

将平板置于37摄氏度的厌氧条件下孵育24小时。最后，计数艰难梭菌菌落，并计算每克粪便内容物中的菌落形成单位。该图显示了小鼠在感染艰难梭菌R20291后数天内的体重变化。

在第0天，将基础体重设为100。随后每天测量小鼠的平均体重，持续14天。在攻毒后的第2至第7天，攻毒组小鼠的体重显著下降。

小鼠在此之后似乎恢复并重新增重。此处显示了攻毒后数天内粪便中艰难梭菌的载量。攻毒后24小时，所有小鼠均已被定植，粪便中菌量达到每克10⁷ CFU。

从第7天开始，该载量有所下降，但艰难梭菌（C.difficile）仍然存在。在感染时间过程中对小鼠进行的组织病理学检查显示，盲肠的病理改变最为显著。挑战后第0天与第2天和第4天的总盲肠组织学评分之间存在显著差异。

通常，初次接触该小鼠模型的研究人员可能在艰难梭菌孢子接种物的计算与制备，以及小鼠粪便中艰难梭菌载量的计算方面存在困难。在实施本方案时，需注意：对给予小鼠的艰难梭菌孢子剂量或菌株进行任何修改，均可能影响该模型的实验结果。