一种表征形态学变化的实验方案 艰难梭菌 对抗生素治疗的响应

本微生物成像方法的总体目标是提供一种更具描述性的手段，以区分药物治疗的表型效应。因此，该方法可在感染性疾病领域发挥重要作用，特别是用于观察特定抗生素对艰难梭菌的形态学影响及其杀菌机制。

该技术的主要优势在于，它将高分辨率成像与体外细胞培养技术相结合，能够详细揭示药物的杀菌作用机制。该技术的应用前景可能延伸至艰难梭菌感染（简称 CDI）的治疗领域，原因是该技术可提供一种手段，用于明确抗生素在治疗 CDI 中可能发挥的有益作用。

尽管该方法可为药物作用机制提供见解，但也适用于其他系统，例如混合培养模型或体内动物研究。通常情况下，人们在应用这一新方法时会遇到困难，因为艰难梭菌的培养和扫描电子显微镜的操作均具有挑战性。我们最初萌生这一方法的想法，是在尝试区分不同抗生素作用模式的过程中。

请允许我向您介绍今天您将见到的研究团队。Jahangir Alam 是一位教授兼微生物学家，他负责协调您今天将看到的所有实验室工作。

塔斯努瓦·拉希德（Tasnuva Rashid）是实验室的一名研究生，负责大量的日常微生物学工作。尤金妮·巴斯雷（Eugenie Bassere）是一名博士后研究员。

她教会了塔斯努瓦许多技能，并且还在实验室中提供帮助。布拉德·恩德雷斯（Brad Endres）是实验室的另一位博士后，他将在张龙（Long Chang）的协助下进行大量的显微镜工作。

在佩戴无菌手套的情况下制备环境分离样本时，使用预先灭菌的棉纱布擦拭任意感兴趣的表面区域，例如地面、门、把手或架子。然后将拭子放入灭菌试管中。每采集一个样本之间需更换手套。

为制备临床分离株，使用接种环将10至100毫克的临床粪便样本接种于头孢西丁环丝氨酸果糖琼脂（cefoxitin cycloserine fructose agar，CCFA）平板上，并在严格厌氧条件下培养48至72小时。将分离得到的艰难梭菌（C. difficile）菌株单菌落保存于冻存管中，置于-80摄氏度冰箱中以供后续分析。使用含0.5%牛磺胆酸钠的脑心浸液（brain heart infusion，BHI）肉汤对环境拭子样本进行增菌培养，并将样本置于37摄氏度的厌氧培养箱中培养5天。

取1毫升培养物，在10,000 × g条件下离心，用100微升乙醇重悬沉淀。取50微升重悬的细胞接种至CCFA平板，在厌氧环境中37°C培养40至48小时。将分离得到的艰难梭菌菌株分装至冻存管中，于-80°C保存，以备后续分析。

使用乳胶凝集试剂或 PCR 检测疑似艰难梭菌（C.difficile）菌落。将纯化的环境或临床艰难梭菌（C.difficile）菌株接种于血琼脂平板上，在厌氧培养箱中 37 摄氏度培养 48 小时。用接种环挑取一个单菌落，转移至 15 毫升离心管中含 5 毫升 BHI 培养基的液体中。

然后将培养物置于37摄氏度的厌氧环境中培养24小时。使用新鲜的、预先还原的添加了牛磺胆酸钠和适当浓度抗生素的BHIS培养基，将预培养物按1:100稀释，使其浓度约为每毫升10⁶ CFU。用移液器在每个时间点收集1毫升样品，并取少量等分试样接种或涂布于血琼脂平板上。

将平板置于37摄氏度的厌氧环境中孵育48小时，计数形成的菌落数量以确定菌落形成单位（CFUs）。在每个时间点收集一毫升细胞至微量离心管中，在10,000 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，并用PBS洗涤细胞。

再次离心样品并弃去上清液。然后用1毫升4%多聚甲醛重悬细胞，于室温孵育1小时。再次离心样品并弃去上清液后，用蒸馏水洗涤细胞两次，再将细胞重悬于100微升蒸馏水中。

根据溶液的浑浊度调整体积。在盖玻片上标记后，向其上加入 40 µL 样品。在通风橱内，将盖玻片孵育 15 分钟，使液体蒸发，并让细胞贴附于玻璃表面。

如果仍有液体存在，请使用吹风机将其去除。将盖玻片放入台式溅射仪中，并用胶带固定。在溅射仪中固定纯金。

然后打开设备，在低压条件下开始溅射。在80微安电流下镀膜30秒，相当于沉积20纳米厚的金涂层。开始成像前，首先在计算机软件中通过点击“Vent”按钮正确对扫描电镜进行放气。

包被细胞后，将其转移至扫描电子显微镜（SEM）中。使用碳导电胶带将包被好的盖玻片固定在金属载物台上。待SEM腔体通气后，门应可轻松打开。

通过旋紧将金属载物台锁定到扫描电镜腔室中。接着，在软件中点击“Pump”按钮。当系统反馈正常后，扫描电镜即可准备使用。

在“探测器”选项卡下，单击SE探测器。通过单击显示电压的按钮来开启电子束。先在较低电压下开始成像，再逐步提高电压。

打开光束后将出现图像。使用追踪功能，在镀膜的盖玻片上找到待成像的区域。放大该区域并寻找杆状结构，这些结构代表艰难梭菌（Clostridium difficile）。

为校准系统，需放大图像，粗略聚焦，并将Z轴与自由工作距离关联。此步骤应在多个工作距离下进行，例如15、9和5毫米。然后切换至超高清成像模式。

使用粗调和微调聚焦旋钮开始在高倍率下进行聚焦。调节像散校正旋钮以获得更清晰的图像，并通过计算机软件对图像进行数字放大，检查图像的清晰度。使用慢速扫描模式采集高质量图像。

将采集的图像保存为 tiff 文件以供后续分析，并确保在分析过程中需要进行测量时已选中数据栏。通过倾斜扫描电镜（SEM）的样品台，从不同角度采集图像，以获取更多的深度信息。在采集慢速扫描图像前，优化聚焦和像散。

成像完成后，关闭电子束并将工作距离增加至20毫米。随后对样品室通气，取出载物台。处理图像，在Fiji中打开图像文件。

使用线条工具精确描记标尺。单击“分析”选项卡，然后选择“设定标尺”功能。此时将弹出一个窗口，要求根据标尺设置已知距离。

同时更改长度单位，然后单击“确定”。最后，为了测量细胞长度，使用直线工具完整地沿细胞轮廓进行描记。再次选择“分析”选项卡，然后单击“测量”。

长度应以先前标明的单位显示。这些图像展示了在生长曲线的指数生长期捕获的艰难梭菌营养细胞以及芽孢细胞。营养细胞呈长而光滑的杆状结构；而芽孢则为具有粗糙外表的小椭圆形结构。

如图所示，对照组细胞生长并达到平台期；而用万古霉素和甲硝唑处理的细胞，其总菌落形成单位（CFUs）下降至检测限，表明具有杀菌作用。结果表明，万古霉素和甲硝唑在高于最低抑菌浓度（MIC）的浓度下对杀灭艰难梭菌（C. difficile）有效。为展示扫描电镜（SEM）在成像艰难梭菌中的应用价值，对药物处理前后的细胞进行了成像，以确定其形态学变化。

对于万古霉素，部分细胞的细胞壁受到影响，而经甲硝唑处理的细胞中有一些体积较小。为了检测细胞大小是否受到影响，使用 Fiji 程序分析了细胞长度。如本图像所示，在对照情况下，营养细胞的大小可能存在一定差异；但大多数细胞长度约为 6 微米。

然而，如本图所示，甲硝唑处理的细胞长度受到影响，而万古霉素处理的细胞则未受影响。一旦掌握，该技术可在两天内完成。在进行此操作时，需牢记样品在镀膜和成像前必须完全固定并彻底干燥。

通过该实验流程，我们还可开展其他方法以回答更多问题，例如细菌对抗生素治疗的反应；这能够帮助我们进一步了解抗生素作用机制。例如，该技术具有巨大潜力，可能为微生物学领域的研究人员深入探索艰难梭菌的生理学与药理学特性开辟新途径。希望您今天喜欢观看本视频。

希望您从中了解到如何培养和表征艰难梭菌（C. difficile）细胞，如何观察抗生素对艰难梭菌的杀菌动力学，以及如何利用高分辨率显微镜评估与这些杀菌模式相关的形态学变化。在操作艰难梭菌（Clostridium difficile）时，我们必须采取额外的预防措施，并穿戴全套防护装备