改良型MicroSecure玻璃化冷冻：一种安全、简便且高效的人类囊胚冷冻保存方法

MicroSecure 胚胎玻璃化冷冻方法的总体目标是为人类胚胎提供一种安全、可靠、简便且有效的无菌封闭式玻璃化冷冻程序。该方法旨在尽量减少人类胚胎玻璃化冷冻过程中的质量控制变量，从而确保结果的可靠性和可重复性。该技术的主要优势在于力求消除不同生物学家及实验室之间的技术差异。

我们的技术操作极为简便，因此对学员而言最大的挑战在于学会如何用移液器操作胚胎而不丢失样本。本方法的核心理念是通过改造两种常用的经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的物品，从而避免对专用设备的依赖：一种是内部带有标记的离子聚合物储存 straw，另一种是无菌 flexipet。

该技术的可视化演示非常有助于突出确保其成功应用的基本技巧。在开始操作之前，将无菌的0.3 ml精液细管放置在基本台式脉冲封口机电极的聚四氟乙烯表面上，位于插头前方，以形成内部密封。按下操作手柄以启动加热，当红灯熄灭并听到蜂鸣声时，松开手柄。

然后在完成装置前，将棉塞向前推压紧内层密封。进行样本的冷冻稀释和囊胚加载时，从培养箱中取出患者的培养皿，并使用第二来源确认所有标本的身份信息。在体视显微镜下，使用玻璃化冷冻移液管（称为 vit tip）将囊胚转移至对应冷冻皿顶行的各个 holding 液滴中。

接下来，用 3 微升 V1 溶液预填充 Flexipet，将其中一半液体 dispense 至第一个胚胎上。吸出胚胎并将其转移至第一个 V1 洗涤液滴中。然后在液滴边缘反复吹打胚胎 2 到 3 次，并将移液管中残留液体排至液滴外的培养皿表面。

然后将囊胚移至单独的V1保存液滴中，并在使用新的玻璃化冷冻尖端吸取其他胚胎之前，先用下一个V2溶液预装该尖端。按照上述方法将所有囊胚依次在V2和V3液滴中洗涤后，在V3保存液滴外清除玻璃化冷冻尖端上残留的溶液和气泡，并从第一个胚胎周围的区域完全吸入干净的V3溶液以充满尖端。推出约1微升体积的液体，随后将囊胚及剩余的V3溶液完全吸入玻璃化冷冻尖端内。

现在，从移液器上取下吸头，并使用无菌纱布垫将玻璃化冷冻尖端外表面残留的 V3 溶液擦干。干燥尖端外表面至关重要，且不会增加胚胎丢失的额外风险。然后将尖端先插入预封口麦管的开口端，并将麦管倒置，使标签端朝下。

观察内塞处的尖端。在开口端留出1 cm的空气间隙，然后安全地焊接密封。当所有麦管均密封完毕后，立即将其浸入不锈钢杜瓦瓶的液氮中，并将麦管存放在患者手杖上连接的开口杯状容器中。

进行冷冻溶液洗脱与稀释时，将相应的六孔稀释培养皿置于体视显微镜载物台中央，并在显微镜一侧放置一个含有37摄氏度蔗糖预温液的60 mm培养皿。接着，取出需要复温的麦管，将麦管上端的封口保持在液面以上，以确认样品身份。使用梅奥剪刀夹住内塞下方的麦管部分，确保玻璃化尖端始终浸没在液氮中。

作为质量控制措施，将剪刀在杜瓦瓶上轻轻敲击数次，以使内管尖端脱离内管侧壁，然后将麦管水平提起至环境空气中，置于体视显微镜表面附近或下方。捏住麦管无标签的一端，在内塞处剪断麦管。随后将麦管提至复温浴皿上方，以60度角将玻璃化尖端倒入复温浴中，直至尖端内容物完全排出。

flexipet的底部应放置在培养皿侧壁上方。5到10秒后，将移液管底部转移至微管移液装置中。启动五分钟计时器。

观察显微镜的同时，用食指盖住吹吸管的气孔，轻轻挤压吹吸球，将玻璃化后的囊胚从玻璃化尖端释放至 T1 洗涤液中。确认囊胚已释放后，通过正压清除残留的 V3 溶液和气泡，将内容物排入一个未使用的废弃孔中央。将玻璃化尖端移至无菌吹吸管上，将胚胎转移至油下第二个 T1 液滴中，继续孵育剩余的四分钟。

孵育期间，用下一溶液预先填充Flexipet，然后每隔3分钟将囊胚依次稀释于T2、T3和T4液滴中。最后，在37°C的表面上将囊胚在T5液滴中平衡5分钟，随后将其放回培养箱。改良的加德纳囊胚评分系统将完全扩张囊胚定义为滋养外胚层细胞疝出小于10%，而疝出程度达50%的囊胚则被归类为扩张囊胚。

囊胚扩张超过50%者被视为正在孵化。采用所述的冷冻保存与复温方法，无论是否进行胚胎植入前遗传学检测，每个周期起始均能持续获得较高的活产率；若使用预先筛选的整倍体囊胚，其成功率尤为显著。

事实上，仅针对具有良好预后的人群评估冷冻保存周期的数据表明，这些冻融胚胎移植的结果在着床率和活产率方面均比全国平均水平高出超过30%。通过主要移植经遗传学检测确认为整倍体的单个冷冻囊胚，无论患者年龄如何，已实现了美国境内最高的着床率和活产率，优于美国疾病控制中心近期公布的另外两家知名生育诊所的统计数据，以及辅助生殖技术学会发布的结果。MicroSecure玻璃化冷冻是一种新型的无菌操作程序，其设计着眼于技术简便性、可靠性以及冷冻过程的安全性。这一简单且非商业化的玻璃化冷冻系统，为现有冷冻装置提供了一种高效且低成本的替代方案。

自开发以来，MicroSecure技术已实现超过99.9%的胚胎回收率和超过95%的完整囊胚存活率。这使得我们在过去三年中将临床实践转变为几乎全部采用冷冻保存胚胎移植周期。我们已有效改进操作流程，在离子性精子细管棉塞前方增加内层密封，从而仍能形成可靠的焊接密封，并获得优异的复温后结果。

如今，在辅助生殖技术行业中使用着多种不同的设备系统，但唯有MicroSecure玻璃化冷冻技术能够以如此简便且技术上可重复的方式，基本消除操作者之间的个体差异，并提供优化的安全性。