囊胚玻璃化冷冻与复温过程中行为客观评估的形态计量学方案

该形态测量方案可用于监测囊胚在玻璃化冷冻前收缩及复温后重新扩张过程中的强度变化，从而评估玻璃化冷冻方法的有效性。该技术的主要优势在于，可应用于配备有延时显微镜以及装有高级图像编辑软件计算机的体外受精实验室。在囊胚发育至第5天或第6天时，对至少含有数个内细胞团细胞且滋养层结构完整的囊胚，在透明带及两个相邻滋养层细胞交界处施加一次持续时间为0.4至0.7毫秒、孔径为4.3至9.4微米的切向激光脉冲。

然后，让囊胚腔完全或部分塌陷，持续五分钟。接着，使用微量移液器无菌地将平衡液加入九孔培养皿的微滴区域孔中，该培养皿专为延时显微成像和记录设计。当全部培养基加入后，在微滴区域上覆盖约 30 µL 的平衡液。

将激光处理后的囊胚浸入微滴培养皿中一个微滴孔底部的平衡培养基中。一旦囊胚转移完毕，立即启动10分钟的倒计时。随后将微滴培养皿转移至配备摄像头的显微镜载物台上。

使用 200 倍放大倍数，调整微滴培养皿的位置，使囊胚大致位于记录视野的中央。随后，启动显微镜记录软件开始录像，并记录下开始录像的时间点。在将胚胎装入玻璃化冷冻 straw 后，需在装载后 80 至 110 秒内密封 straw，并将其迅速浸入液氮中，随后将囊胚保存于 -196 摄氏度条件下。

为了在平衡阶段测量监测中的囊胚的横截面积，将快速选择工具标记置于囊胚内部，直至接触囊胚边缘，然后反复点击并按住鼠标左键，勾勒囊胚的外缘，直至整个囊胚的横截面积被选中。随后，在时间轴窗口中点击测量日志并记录测量值。对于囊胚再扩张，需迅速将装有玻璃化冷冻囊胚的HSV吸管从储存容器转移至装有液氮的便携式储存罐中。

用镊子将吸管轻轻抬起至刚好露出彩色操作杆的位置。使用自调节剥线钳在彩色操作杆的高度处切断吸管。然后以快速而受控的动作将操作杆从吸管中取出。

立即将操作杆的弯曲刮勺浸入盛有37摄氏度解冻液的容器中，并轻轻旋转操作杆以使囊胚脱离。一分钟后，用稀释液依次进行四次、每次四分钟的洗涤。

洗涤液一和洗涤液二。接着，将已预热的囊胚转移至含有新鲜回收培养基的四孔培养皿中，并用移液器在全部三滴培养基中清洗囊胚。最后一次清洗后，将囊胚转移至含有回收培养基的九孔延时成像培养皿中。

将九孔培养皿置于37摄氏度、6% CO2和5% O2培养箱中的延时摄影显微镜下。打开延时成像记录软件，选择记录用摄像头。选择实时模式，并将光标置于图像上。

滚动以放大图像，并使用鼠标左键将含有囊胚的孔置于屏幕中央。在聚焦时，使用箭头键调整囊胚成像平面的焦距，在光照强度设置中调节图像的光照强度。单击显微镜参数以设置曝光时间和伽马值，然后单击关闭实时模式。

单击“开始项目”以进入项目数据界面。选择培养皿类型，并取消勾选除待记录位置之外的所有位置。然后，将捕获时间设置为每五分钟拍摄一张照片，单击“批准”以至少记录150分钟的囊胚重新扩张过程。

在此具有代表性的持续监测的完整胚胎中，完整的囊胚在平衡液中并未完全塌陷，经平衡液处理10分钟后重新扩张至原始大小的约70%。相比之下，经激光处理后人工塌陷的囊胚其囊胚腔立即完全排空，在接触平衡液的10分钟内未观察到明显的重新扩张。当使用含有高浓度冷冻保护剂的玻璃化冷冻液处理时，该已平衡的完整囊胚表现出囊胚腔逐步缩小的过程。

复温后，该囊胚在接触复苏培养基时再次扩张。然而，经激光脉冲处理的囊胚在激光作用下囊胚腔立即塌陷，且在平衡或玻璃化冷冻步骤中未恢复，这引发了对于已塌陷囊胚是否需要如此长时间平衡阶段的质疑。该方案还揭示了囊胚在复温后重建囊胚腔的能力。

例如，解冻后囊胚腔的重新扩张可能是线性的，也可能因多次较大或较小的收缩而中断。在进行该操作时，需注意胚胎在记录过程中必须尽可能短时间地停留在培养皿底部。请勿忘记，高浓度的冷冻保护剂可能对胚胎具有毒性。

每次技术进步都为低温生物学领域的研究人员探索体外受精项目中冷冻保存方案的有效性铺平了道路。