小鼠牙髓直接盖髓模型的建立及其在牙髓创面愈合与修复性牙本质形成评价中的应用

本方案的总体目标是展示在小鼠中进行直接盖髓术的操作过程。该方法有助于回答牙髓生物学中的关键问题，例如，当将盖髓材料置于暴露的牙髓表面时，牙髓如何愈合，或修复性牙本质如何形成。该技术的主要优势在于，临床上用于人类的直接盖髓术可完全以相同的方式在小鼠中实施。

该技术的应用意义在于改善材料性能，从而挽救那些原本需要接受更侵入性治疗（如根管治疗）的牙齿。在对小鼠进行适当麻醉后，将其口腔固定器置入其口腔内，并将另一端固定于实验台上，使头部朝上。在良好照明条件下，使用体视显微镜观察上颌第一磨牙。

然后，使用高速手机以 200,000 rpm 的转速配合四分之一圆钻针，去除牙齿釉质的中央区域，直至通过透明的牙本质可见牙髓。注意不要穿透进入牙髓。接下来，使用编号

使用15号根管K锉，穿透牙本质并暴露牙髓。切勿将任何碎屑推入牙髓腔内；可通过每四分之一圈旋转K锉后即刻将其退出的方式来避免此问题。现在，制备MTA材料，使用探针将MTA输送至暴露区域，然后用纸尖的背面轻轻敲打，将MTA压实至暴露部位。

接下来，使用装有35%磷酸酸蚀剂的注射器将酸蚀剂涂布于牙面，注意避免接触牙龈组织，酸蚀15秒。15秒后，用吸唾器吸除牙面的酸蚀剂，并用蘸水的棉签擦拭去除任何残留的酸蚀剂。反复吸除和擦拭，直至彻底清除所有酸蚀剂。

使用纸尖的背面涂抹牙科粘接剂。用压缩空气吹数秒钟，使粘接剂形成薄层。然后用适当的光源照射30秒，使粘接剂固化。

现在，使用探针的尖端将少量复合树脂涂布于牙齿表面，使复合树脂流入牙齿的窝沟内。涂布完成后，光照固化30秒。在处死小鼠并取出整个上颌后，将颌骨置于pH 7.4的PBS中含4%多聚甲醛的溶液中固定。

将组织在 4 摄氏度下保存过夜，次日早晨转移至 70% 乙醇中储存，直至进行后续处理。为获取上颌骨的显微 CT 扫描图像，首先将其固定于浸有 70% 乙醇的纱布中，然后装入 15 毫升细胞培养管内。随后将该管置于显微 CT 扫描仪的样品台上。

接下来，将X射线源设置为以55千伏峰值和145微安电流照射200毫秒。使用0.5毫米铝滤膜，以20微米分辨率采集图像。扫描完成后，用含5% EDTA和4%蔗糖的PBS溶液（pH 7.4）开始对上颌骨进行脱钙处理。

将此反应在 4 摄氏度下持续进行两周。在包埋上颌骨后，切取 5 µm 厚的切片。牙髓盖髓区域通常与远中腭侧根重合，可作为解剖标志。

通过光学显微镜观察组织学切片，并将其结果与微计算机断层扫描（micro CT）图像进行比较，以确定精确的目标区域。对于苏木精-伊红（H&E）染色，先用二甲苯浸泡两次，每次数分钟，以去除石蜡，随后将切片依次通过梯度稀释的乙醇进行再水化处理。

每种染色液应作用一分钟。复水后进行冲洗，然后加入苏木精染色液作用两分半钟。

用冲洗液洗去染料，然后将切片放入95%乙醇中一分钟。接着用伊红溶液染色一分钟，再冲洗干净。从乙醇开始，逆向进行脱水步骤，使染色的组织脱水。

然后用二甲苯处理。随后即可封片并进行成像。采用所述方法，对8周龄小鼠进行了盖髓术。

六周后，取其上颌骨进行收获并检查。令人好奇的是，H&E 染色显示牙髓腔和根管内均有牙本质形成。相比之下，未盖髓的磨牙则未显示出相同的牙本质形成。

在闭合的磨牙中，修复性牙本质同时表现出类牙本质和类骨组织形成的特征，因为其中既发现了牙本质小管，也发现了骨细胞，提示受损的牙髓可能由残存的成牙本质细胞和迁移而来的成骨细胞共同矿化。采用DMP1免疫组织化学染色进一步证实了形成修复性牙本质的细胞活性增强。与真实的牙科临床操作一样，有助手协助极为有益。

例如，一旦掌握该技术，在助手的协助下仅需十分钟即可完成。重要的是，在暴露牙髓时，务必使用根管锉（endofile），而非车针（bur）。在操作MTA时，需格外小心。

请务必注意，使用多聚甲醛等固定剂可能具有极高危险性。应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。