黑腹果蝇 心脏功能的制备与纵向成像 体内 使用光学相干显微成像技术（OCM）

本实验的总体目标是利用光学相干显微技术对果蝇（Drosophila）活体心脏功能进行纵向成像。该方法可通过提供诸如心脏直径变化、心率以及果蝇变态期间心脏活动周期等参数，帮助解答果蝇心脏结构与功能发育领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，光学相干显微技术能够以高空间和时间分辨率对小型动物心脏进行无创成像。

由于果蝇与脊椎动物之间存在遗传相似性，该技术可能有助于揭示人类心脏疾病的机制以及与心脏发育的关系。该方法还可应用于其他系统，例如利用光遗传学起搏技术研究或治疗动物模型中起搏功能减弱的情况。在为本实验培育果蝇时，应让具有繁殖能力的亲代果蝇在新鲜的培养管中交配并产卵八小时。

因此，所产的一批卵将发育为年龄相近的果蝇。为进行OCM成像，首先准备一段带有双面胶的洁净载片，并将胶带下方困住的气泡排出。

接下来，使用软毛刷从试剂瓶中取出一只大小合适的幼虫，将其放置在干净的纸巾上。用湿润的刷子清除幼虫身上粘附的食物残渣，然后让其自然干燥。

现在，在宽场显微镜下确认幼虫的发育阶段。然后，将幼虫背侧朝上放置，以便固定。接着，将粘性载玻片轻轻压在幼虫上，并施加适中压力使其牢固粘附于胶带。

将固定好的幼虫置于OCM系统的可调载物台上，沿y轴横向方向摆放，使背侧朝上。载物台上的一个小孔可防止幼虫与载物台平面直接接触。心脏管的宽阔管腔位于A5至A8节段。利用计算机上的实时图像，找到心脏管的后部区域，并向前移动载物台，直至A7节段可见。

现在，设置图像采集的参数。每个B-scan使用100次A-scan，共采集100个B-scan。然后，将扫描器电压设置为在x横向方向上覆盖约0.28毫米，并在y横向方向上设置为0伏。

接下来，用深色布料遮挡样品光路，并在软件中点击开始按钮，以采集背景噪声数据用于背景扣除。为采集横向M模式图像，将参数调整为每次B扫描包含128次A扫描，并使用4,096次B扫描。然后，重新调整电压，使x方向覆盖0.28毫米，y方向为0伏，如同之前一样。

然后，对果蝇心脏管的 A7 节段进行横向 M 模式成像。在数据保存过程中，使用深色布料遮挡成像光束，以尽量减少样本的光照暴露。重复成像心脏五次，以获得可靠的心功能测量结果。

为了采集三维图像，每幅B扫描使用400次A扫描，共800幅B扫描，并在x轴横向和y轴横向分别施加1.7毫米和约4毫米的电压。然后移动显微镜载物台以观察整只果蝇，并调节焦距以获得清晰的图像。若需移除幼虫，应使用湿润的软毛刷将其转移至含有新鲜培养基的新试管中，以继续其发育并进行纵向研究。

在蛹期PD1阶段，心脏管的宽阔管腔仍存在于A5至A8节段。在PD1阶段，应尝试对A7节段进行成像，操作方式与L2和L3龄幼虫相同。PD1蛹期可通过白色蛹壳来识别。

这一时间段是进行早期蛹体光学成像的理想时机，因为高透明度可为OCT成像提供更强的光穿透性。若食物残渣附着在蛹体上，可用毛刷将其清理干净。使用湿润的毛刷将蛹体固定在小块载玻片上，并使其背侧朝上。

应将载玻片放入果蝇培养管中，以在其独立的培养空间内维持动物的正常发育。将蛹表面多余的水分吸干，然后将其放置在载物台上，使蛹朝上，接着对A7节段进行成像，操作方式与幼虫相同。成像完成后，将带有蛹的玻璃载玻片转移至培养管中继续培养。

PD1 阶段之后，从 PD2 开始，A1 和 A4 节段之间开始形成一个圆锥形腔室。由于蛹体逐渐变得不透明，成像系统的穿透深度随之降低。在 PD2 时，蛹壳呈现黄色，身体的透明度较 PD1 时更低。

在PD3阶段，蛹的颜色比PD2阶段略深。到PD4阶段，可在蛹壳内观察到黑色条纹。部分PD4个体将发育为成虫，而另一些则进入PD5阶段。

在PD5阶段，黑色条纹更加明显。用镊子夹起一只PD2期蛹，将其固定在载玻片上。在OCM系统中，找到心脏管的前端，然后向后端移动约50微米，以定位心脏管的A1节段。

请注意，在PD2阶段，心脏的圆锥腔非常小，可能尚未开始搏动。按照之前所述进行成像。对PD3、PD4和PD5阶段的果蝇重复相同的成像步骤。

首先，将成年果蝇转移至一个体积约为45毫升的空瓶中。然后，将棉签浸入麻醉溶液中，并将棉签的棉头端从棉塞下方插入瓶内，棉头位于棉塞正下方。等待三分钟。

成年果蝇将根据其体型大小，进行2.5至3.5分钟的麻醉。现在准备一张载玻片，并在其上贴一小段双面胶带。然后用柔软的毛刷将麻醉后的果蝇转移至载玻片上，使其背面向上。

在宽场显微镜下，使用镊子分离翅膀，并将其粘附到胶带上，从而暴露心脏区域以便成像。接着，使用前述成像技术对心脏的 A1 节段进行成像，并在实验结束时处死果蝇。纵向心脏成像采用携带一份 24B-GAL4 驱动子的品系果蝇进行。

在幼虫阶段，心脏管从后腹部第A8节开始，管腔较宽，向前延伸至前背侧第A1节，直径逐渐变窄。在PD2晚期，从A1至A4节段开始发育出一个圆锥形腔室。果蝇的心率是通过横向M型光学相干显微图像进行量化的。

有趣的是，在蛹期阶段，心脏偶尔会停止跳动。总体而言，心脏搏动从幼虫阶段到蛹期显著减慢，随后从蛹期到成虫阶段又大幅加快。随着这一发展，该技术为发育心脏病学领域的研究人员提供了一种新工具，可用于探索各种基因对黑腹果蝇（Drosophila）模型心脏发育的影响。

在进行该实验操作时，重要的是要仔细追踪黑腹果蝇的发育过程，以便在每个发育阶段获取相应的图像。