建立用于心脏功能成像与光遗传学调控的 Drosophila melanogaster 模型

该方案介绍了利用光来表征和控制果蝇心脏功能的果蝇模型。这使得研究人员能够在完整动物体内研究人类心脏疾病。该方法可稳定实现对果蝇心脏功能的非侵入性光学相干断层成像（OCT）及光遗传学控制。

它具有高效率和高质量。光遗传学起搏有望作为治疗心律失常疾病的电起搏替代疗法。OCT成像和光遗传学起搏可拓展至其他模型系统，如心脏类器官、斑马鱼以及胚胎期咽喉和心脏。

首先，将五只携带 GAL4 和 TM6 双标记的处女雌蝇与两到三只来自 UAS Ops 和 Stocks 的雄蝇每管进行杂交。第二天，根据布卢明顿果蝇资源中心的说明配制半定义培养基：将 5.14 克/100 毫升蔗糖加入烧杯中，在加热板上加热溶解，并持续搅拌，冷却至 60 摄氏度。

接下来，通过向每个窄口果蝇培养瓶中加入 50 µL 的 100 mmol/L 全反式视黄醛乙醇溶液来制备培养瓶。使用刻度移液管将每支窄口果蝇培养瓶中的果蝇培养基移除 5 mL。在最大速度下涡旋振荡 10 秒后，塞住这些培养瓶，并用遮光布包裹，以避免光照。

第二天，将稳定产卵的果蝇转移至含有全反式视黄醛乙醇溶液处理食物的试剂瓶中。用遮光材料保护装有试剂瓶的架子。根据产卵数量，24至48小时后，丢弃亲代果蝇，以防止试剂瓶内果蝇过度繁殖。

接下来，收集非肥胖型后代用于心脏成像。从试剂瓶中挑选带有UAS选项的hand GAL4幼虫或蛹，将其放置在组织上，并使用画笔轻轻擦去体表的培养基。在载玻片中央贴上一小段双面胶，以备使用。

接下来，使用毛刷或精细镊子将幼虫或蛹轻轻放置在胶带表面，使其背面向上，并与载玻片的长边垂直。施加轻柔压力，使幼虫或蛹附着在胶带表面。然后，将载玻片放置于成像台上，使幼虫或蛹朝下，并通过激光控制软件开启光学相干断层扫描（OCT）光源。

打开自行编写的频域OCT控制软件，然后点击预览窗口，接着在频域OCT软件中设置扫描参数。

使用显微操作仪控制样品台，使果蝇心脏进入焦点。调整焦平面位置，以最小化果蝇体壁表面的光反射。此外，可考虑在幼虫或蛹的表面涂抹矿物油，以减少反射。

接下来，设置M模式OCT图像采集的扫描参数，并采集五组无红光刺激脉冲的对照数据，以计算静息心率。在自定义OCT控制软件中设计用于起搏刺激的光脉冲。具体操作为：点击设置选项卡，根据不同的刺激方案，将设计好的光脉冲序列添加至控制参数中，以调节脉冲频率、脉冲宽度、刺激持续时间和等待时间。

然后打开光控制器软件以生成红光脉冲。在模式选择中选择脉冲模式。双击脉冲轮廓设置的图形，并选择跟随模式。

保持关闭强度为零，并在计算实际功率密度后设置开启强度百分比。在OCT控制软件中点击“Acquire”，获取光刺激下果蝇心脏跳动的M模式视频。在成像采集过程中，记录红光脉冲照射果蝇心脏的情况。

请注意，使用红移型通道视紫红质和NPHR果蝇模型控制果蝇心脏功能时，需要不同的起搏设置。打开自主开发的果蝇心脏分割软件，点击“选择文件”，然后在图形用户界面中选择待分析的文件。

在顶部的文本框中输入心脏区域的垂直和水平边界（单位：像素）。点击“resize”按钮。使用底部的滑块，确保整个心脏区域可见，并在整个采集过程中充满整个框。

单击“预测”标签后，程序将遍历集合中的每个切片，并在大约三分钟内自动选定心脏区域。预测完成后，单击心率（HR）图，将在新窗口中显示随时间变化的心脏区域曲线图。选择正确的峰值或谷值区域，然后依次选择脉冲和心率（HR）标签，以生成最终图像。

功能参数将同时保存在CSV文件中。通过成像绿色荧光蛋白表达验证了手部GAL4驱动器的组织特异性。此处展示了幼虫和蛹体横截面的典型OCT图像。

为了模拟不同的心脏状态，设计了四种类型的光脉冲。一种是在等待5秒后持续10秒的单次脉冲，可诱导可逆的心脏停搏。对于起搏频率低于静息心率的心脏起搏，采用两种光脉冲序列，其起搏频率分别等于静息心率的一半和四分之一，每次序列持续8秒，间隔6秒等待时间。

通过红移通道视紫红质激活来提高心率的刺激模式由三组光脉冲序列组成。光信号引起的心脏收缩频率降低，导致心率减慢，该现象在幼虫和蛹中均能观察到。在幼虫和蛹的心脏上施加一系列不同刺激频率的三组光脉冲串，可明显观察到光脉冲后心率增加。

正确选择子代、标本的制备与固定，以及成像步骤至关重要。我们希望将光遗传起搏技术应用于更大的动物模型，以研究哺乳动物的心脏疾病，并探索治疗心律失常的新疗法。