使用稳定同位素示踪法测量复杂细胞群中分选亚群代谢的实验方法

该方法的总体目标是利用同位素示踪技术来测量复杂细胞群中分选后细胞亚群的代谢情况。通过该方法，我们能够研究复杂细胞群中不同亚群之间的代谢差异，以及这些亚群之间的代谢协作关系。该技术的主要优势在于，将同位素示踪与细胞分选相结合，可以获得更为可靠的代谢测量结果，同时还能验证该方法本身的可靠性。

该方法的可视化演示至关重要，因为它结合了多种技术，而细胞的处理方式及操作时长可能会影响细胞代谢。从培养皿中提取代谢物时，首先在六孔板中使用含有透析添加剂的稳定同位素标记培养基培养细胞。当细胞达到75%融合度时，用500微升含均匀标记葡萄糖的冷HBSS溶液冲洗孔板两次。

然后向每孔加入 600 µL 预冷至干冰温度的 100% 甲醇，并将培养板置于干冰上。使用细胞刮刀刮下细胞，随后小心地将每孔中的提取物转移至各自的微量离心管中。在质谱分析前，将细胞样品于 -80 °C 保存。

对于分选细胞的代谢物提取，使用添加了透析补剂的标记培养基，在100毫米培养皿中培养细胞，使其在分选当天达到75%的融合度。对于细胞周期分选细胞的脉冲标记，先在含有透析补剂的未标记培养基中培养细胞，直至其达到75%的融合度。随后，更换为新鲜的标记培养基，对细胞进行两小时的脉冲标记。

用含有均一标记葡萄糖的温热 HBSS 冲洗培养皿，并加入 1.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度下消化细胞。四分钟后，加入 3 毫升含有标记葡萄糖和透析补充物的冰冻 HBSS 以终止胰蛋白酶反应，将细胞转移至 15 毫升锥形管中进行离心。将细胞沉淀重悬于含有标记葡萄糖、透析补充物和 EDTA 的 HBSS 中，细胞浓度为每毫升一至二乘以十的六次方个细胞，并通过 40 微米细胞筛网过滤，获得单细胞悬液。

将细胞转移至一个5毫升离心管中，并使用流式细胞仪进行分选。对于模拟分选细胞的代谢物提取，需排除碎片并仅分选单细胞群体。对于细胞周期分选细胞的代谢物提取，需排除碎片和双细胞群体，并根据geminin探针的荧光信号将细胞分选至G1期和SG2M期。

分选结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于50 µL预冷的蒸馏水中，以获得均一的沉淀。随后加入540 µL干冰冷却的甲醇，迅速提取代谢物。将样品于-80 °C保存，直至进行LCMS分析。

从分选后的细胞中提取代谢物必须提前周密规划，并尽可能快速完成实验操作，以最大限度减少代谢物的变化。在对提取的代谢物进行分析时，首先选择若干具有相应可用标准品的代谢物，这些代谢物应表现出良好质量的样品峰。接着，验证峰的质量，注意避免将假同位素峰包含在内。

通过将各组分中每种质量同位素的峰面积除以该组分中所有质量同位素的总峰面积，计算标记同位素样品中各组分的质量同位素比例。然后，使用碳富集公式计算碳-13富集的标记碳分数。最后，使用氮富集公式计算氮-15富集的标记氮分数。

在此代表性实验中，从数据分析中选出的66种代谢物在模拟分选细胞中均被检出，其中60种在培养皿提取物与模拟分选细胞之间的分布中显示出与我们分布来源相似的同位素质量标记。例如，谷氨酸的同位素质量分布在线粒体与模拟分选细胞提取物之间相似，表明我们分布来源的谷氨酸同位素质量在分选细胞群体中同样可靠。利用FUCCI geminin探针对HELA细胞按G0、G1或SG2M细胞周期阶段进行分选后的分析显示，两种细胞群体中均存在胞苷标记，且SG2M阶段的富集程度更高，这与S期期间核苷酸从头合成增加的结果一致。

在本实验中，我们所检测的分布中质量同位素在细胞周期分选的两个组分中均表现出相同的模式，表明两者使用相同的合成途径，但在SG2M阶段活性更高，这证明该方法能够轻易检测到不同亚群之间（即使是亲缘关系密切的亚群）的代谢差异。观看本视频后，您应能够熟练掌握如何从分选后的组分中提取代谢物，并理解其中的注意事项。在进行该操作时，必须注意在细胞分选和代谢物提取过程中快速处理细胞，因为操作方式及处理时间的长短均可能影响细胞的代谢状态。

一旦掌握，该技术可在五小时内完成。此方法也可应用于其他细胞类型，例如血液中的免疫细胞亚群，或肿瘤内的不同细胞类型，可使用多种探针、抗体或染色方法进行分选。