基于同位素示踪实验组合的工作流程以研究微生物对多种营养源的代谢

本实验的总体目标是利用标记底物定量研究多种营养物质的代谢过程。该工作流程可用于确定被消耗营养物质的去向以及酵母合成化合物的代谢来源。该方法有助于解答微生物代谢领域中的一些关键问题，例如在不同环境条件下整个代谢网络如何运行。

该技术的主要优势在于能够阐明并量化来自多种来源的营养物质蛋白的分布情况。该方法曾被用于研究酵母的氮代谢，但也可应用于其他代谢过程及微生物。本实验成功的关键在于发酵过程的可重复性。

用户必须特别注意收集处于相同定义生理阶段的细胞。演示该实验操作的人员包括本技术团队的 Christian Picou、实验室的博士研究生 Pauline Seguinot 以及博士后研究员 Stephanie Rollero。在高压灭菌锅中，将为每种氮源配制的合成培养基分别放入含磁力搅拌子的 1 升锥形瓶中进行灭菌处理。

溶解适量的标记分子，使培养基中达到所需的最终浓度。使用一次性真空过滤系统对培养基进行灭菌。用无菌量筒将培养基均分至两个预先灭菌的发酵罐中，每个发酵罐内含磁力搅拌子，并配备发酵锁，以防止氧气进入，同时允许二氧化碳释放。

在YPD培养基中培养酿酒酵母菌株后，于超净工作台中收集预培养物的等分试样，并使用配备100微米孔径的电子颗粒计数器对细胞数量进行定量。将预培养物离心后，将沉淀重悬于适量无菌水中，以获得每毫升2.5 × 10⁹个细胞的终浓度。随后，向每个发酵罐中接种1毫升细胞悬液。

随后，通过将发酵罐安装在已正确放置于21孔搅拌板上的支撑导轨中，构建发酵平台，并将搅拌速率设定为270 RPM。为启动每条发酵过程的在线监测，运行机器人控制应用程序，点击“开始检测”按钮，并选择要进行的发酵体积。为确保显示界面能够指示平台上发酵罐的数量和位置，可右键单击槽位位置，选择“禁用”以关闭对空位的监测。

初始化计算软件时，单击“Initializer”按钮，然后点击“OK”确认。接着，单击机器人控制应用程序中的“Start”按钮以开始重量采集。随后，取自发酵罐的两份六毫升样品在四摄氏度条件下以2,000 ×g离心五分钟。完成后，将每份冷冻上清液转移至两个离心管中，并于负80摄氏度保存。

将每个沉淀物用5毫升蒸馏水洗涤两次，并于-80摄氏度保存，用于同位素富集度测定。向800微升样品中加入200微升含有2.5毫摩尔正亮氨酸（作为内标）的25%磺基水杨酸溶液，以去除高分子量分子。孵育并离心后，将混合物通过0.22微米孔径的硝酸纤维素膜过滤，然后将样品放入氨基酸分析系统中。

在分析系统的程序或软件中，点击“运行”按钮，使用配备阳离子交换柱的分析仪开始液相色谱分析。接着，通过将先前制备的标记细胞沉淀悬浮于 200 微升过甲酸中，制备氧化提取物。在 4 摄氏度下孵育 4 小时后，加入 33.6 毫克硫酸钠以终止反应。

向氧化后的提取物中加入800微升6摩尔/升的盐酸，在干燥烘箱中，于110摄氏度下将样品置于密封玻璃管中孵育16小时。待样品冷却至室温后，加入200微升2.5毫摩尔/升的内标物神经亮氨酸，并通入氮气流去除氯化氢气体。用800微升蒸馏水将干燥的提取物洗涤两次，然后再用800微升乙醇洗涤。

然后，向提取物中加入 800 微升 200 毫摩尔的醋酸锂缓冲液。使用先前所述的色谱方法测定样品中蛋白质内氨基酸的相对浓度。通过加入 1.2 毫升 6 摩尔的盐酸并将在干燥加热烘箱中、密闭玻璃管内于 105 摄氏度孵育 16 小时，对标记的细胞沉淀进行水解。

待样品冷却至室温后，加入1.2毫升蒸馏水。离心去除细胞碎片后，将上清液分装至六个敞口玻璃试管中，每管400微升。将各管样品置于干热烘箱中，在105摄氏度下干燥四到五小时，直至其达到糖浆状稠度。

在生物质水解过程中，通过频繁控制操作酸度，将组分干燥至糖浆状稠度。进行ECF衍生化时，将冷却后的干燥水解物溶解于200微升20毫摩尔盐酸和133微升吡啶与乙醇按1:4混合的溶液中。加入50微升氯甲酸乙酯以衍生化氨基酸。

二氧化碳释放后，将混合物转移至含有500微升二氯甲烷的离心管中，以萃取衍生化化合物。涡旋振荡样品10秒。在10,000 ×g条件下离心4分钟后，用巴斯德吸管收集每个样品的下层有机相，并转移至含有锥形玻璃插件的气相色谱自动进样瓶中，以便每个样品可直接注入气相色谱-质谱联用仪（GCMS）中。

高效液相色谱衍生化试剂用于ECF步骤。需频繁更换ECF试剂。进行DMF-DMA衍生化时，将干燥的水解产物溶解于50 µL甲醇和200 µL乙腈中。

加入300微升DMF-DMA，涡旋混匀样品。然后将样品转移至含有锥形玻璃插件的GC自动进样瓶中。进行BSTFA衍生化时，将水解产物悬浮于200微升乙腈中。

向样品中加入 200 微升 BSTFA，并将玻璃管密闭。在 135 摄氏度下孵育 4 小时后，将冷却的提取物直接转移至含有锥形玻璃插件的气相色谱自动进样瓶中。随后，使用配备自动进样器进样装置并与质谱仪联用的气相色谱仪分析样品。

在计算机软件的菜单中点击“Instrument”。在“Sequence”选项卡下，点击“Edit Sample Log Table”以创建样品列表，然后点击“Run”和“Run Sequence”开始进样。分析完成后，记录每种氨基酸对应的各个质量同位素异构体的一组强度值。

在15毫升玻璃管中加入10微升适当的氘代内标至5毫升上清液中。加入1毫升二氯甲烷， tightly 密封试管，并在摇摆平台上震荡样品20分钟。离心后，收集下层有机相至另一15毫升玻璃管中。

重复二氯甲烷萃取后，用500毫克无水硫酸钠干燥有机萃取液，并用巴斯德吸管收集液相。在氮气流下将萃取液浓缩至原体积的四分之一。然后，将浓缩后的样品转移至气相色谱自动进样瓶中。

进行气相色谱-质谱（GCMS）定量时，注入两微升样品，分流比为10:1，并采用适当的色谱柱升温程序分离提取的挥发性分子。根据文本方案中的电子表格，输入与胞外氨基酸浓度、细胞干重、细胞蛋白含量、挥发性分子浓度以及蛋白质源性氨基酸和挥发性分子同位素富集度相对应的原始数据。下图展示了研究酵母在葡萄酒发酵过程中如何调控多种氮源利用的工作流程示意图。

在不同的取样时间点，各次发酵之间的生物学参数表现出高度的可重复性。此处展示了氮元素从葡萄汁中的来源向所有蛋白质氨基酸重新分配的总体情况。结合质量平衡的测定，对蛋白质氨基酸同位素富集度的测量首次实现了定量分析，明确了来源于精氨酸、谷氨酰胺、铵盐及其他氮源的氮对每种化合物中氨基基团的贡献程度。

此处展示了消耗的氨基酸直接转化为生物量的比例比较。图中显示了脂肪族氨基酸亮氨酸和缬氨酸在酵母代谢网络中的分配情况。超过96%的消耗性缬氨酸和亮氨酸在其转化产物中得以回收。

令人惊讶的是，尽管培养基中缬氨酸和亮氨酸的供应量与其在生物量中的含量存在显著不平衡，仍有相当一部分被分解代谢。掌握该技术后，可在五天内完成实验。在进行该操作时，重要的是要牢记根据科学问题仔细选择底物的标记部位。

为确保良好的生物学重复性，应将发酵和色谱分析各进行两次。该技术建立后，为微生物学领域的研究人员探索微生物的代谢和生理特性如何随环境条件变化提供了途径。请注意，使用衍生化试剂和精氨酸溶剂时可能存在极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如佩戴手套并在通风橱内操作。