原位检测与单细胞定量金属氧化物纳米颗粒的核微探针分析方法

由于具有独特的理化性质，纳米颗粒在工业和医学领域的应用日益广泛。然而，长期暴露于纳米颗粒对人类健康可能带来的风险仍令人担忧。这些风险可通过研究纳米颗粒在细胞内的行为及其诱导的细胞代谢反应来加以量化评估。

这在一定程度上是由于缺乏能够在单个细胞水平上检测和定量内化纳米颗粒的方法。尽管已有多种分析工具（包括显微镜和质谱）可用于评估纳米颗粒的细胞摄取，但这些方法仅能在微观层面提供定性信息。相反，基于原子光谱的原位方法可减少样品制备过程中产生的成像伪影，并能实现对纳米颗粒的直接观察。

为了利用这一优势，我们提出了一种相关联的方法，可使我们研究处于天然状态或经荧光标记的纳米颗粒。本文描述了一种基于荧光显微镜与核微探针分析相结合的技术。该方法可提供细胞密度、化学元素空间分布以及每个细胞中纳米颗粒数量的图像。

作为示范，我们将利用荧光显微镜和核微探针分析，研究细胞在二氧化钛纳米颗粒中暴露24小时后的反应。本实验方案需要使用由聚合物PEEK制成的定制样品架，该样品架必须适用于细胞培养以及体外观察。

用厚度为2微米的聚碳酸酯薄膜覆盖样品台。将聚碳酸酯薄膜用一层薄薄的Formvar溶液粘附到PEEK培养皿上。安装完成后，需要对样品台进行灭菌处理。

可将多个无菌样品架分别存放于无菌的十二孔板中，每孔一个，直至使用时取出。利用荧光显微镜检测转染了基质行GFP质粒的细胞，以确认转染成功并表达荧光蛋白。用胰蛋白酶消化收集细胞，并于37摄氏度孵育3分钟。

通过加入新鲜培养基终止胰蛋白酶的作用。在4°C条件下，以1200转/分钟离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并加入适量新鲜培养基。

计数细胞，并用新鲜且恒温的完全培养基进行稀释，制备成每微升含500个细胞的细胞悬液。取40微升细胞悬液滴加在聚碳酸酯膜的中央。将样品小心放入细胞培养箱中孵育2小时。

轻轻加入两毫升新鲜培养基，静置24小时。本研究设计、合成并接枝了常用荧光染料的荧光双修饰二氧化钛纳米颗粒，以用于体外检测、追踪和定位纳米颗粒。在此步骤中，应预先配制浓度为每毫升一毫克的超纯水中二氧化钛纳米颗粒悬浮液。

在室温下使用持续一分钟的高强度超声处理分散纳米颗粒。将纳米颗粒用适当的培养基稀释，制备成每平方厘米含4微克的暴露悬浮液。将原有的细胞培养基更换为含有纳米颗粒的新培养基，并轻轻混匀以实现纳米颗粒的均匀分布。

以相同方式制备一组对照细胞，但不添加二氧化钛纳米颗粒。将细胞群体培养24小时。使用多聚甲醛固定这些样品，随后可进行原位和单细胞成像，采用荧光显微镜观察。

然而，低温物理固定能够保存细胞的超微结构和生物化学完整性。浸入式冷冻固定可在数毫秒内迅速终止细胞活动，并避免使用固定剂化合物。为实现细胞的低温固定，我们执行以下步骤。

通过将铝制转移板置于液氮中冷却来制备。将该板储存在装有液氮的容器中，使板表面位于液面之上，处于低温氮气蒸气中。将足量的2-甲基丁烷冷却至-150摄氏度。

准备一个装有培养基的50毫升Falcon管，以及两个装有超纯水的Falcon管。在冷冻样品前，确保附近备有吸水纸用于干燥样品。用培养基冲洗细胞一次，再用无菌超纯水冲洗两次，以去除培养基中残留的过量盐分。

用吸水纸快速吸干样品。将细胞浸入预冷的2-甲基丁烷中冷冻30秒，然后置于预冷的铝制转移板上。在此过程中，必须尽可能保持容器密闭，以防止水蒸气在低温板表面凝结。

所有样品冷冻后，采用以下方法进行冷冻干燥，以升华去除所有水分。首先，在低压和低温条件下进行12至24小时的初级干燥。接着，在保持低压的同时，将板温升至40摄氏度，进行至少24小时的次级干燥阶段。

冷冻固定后，样品可在无菌、干燥且防尘防潮的条件下于室温保存数天。核微探针分析在法国波尔多的Ifera设施进行。一台3.5兆伏单级静电加速器提供能量范围在兆电子伏特区间的轻离子束。

利用微探针光束线上的互补离子束分析技术，开展了化学元素成像研究。所采用的技术包括微束PIXE（粒子诱导X射线发射）、STIM（扫描透射离子显微术）和微束RBS（卢瑟福背散射谱学）。样品置于分析室内部，在真空条件下用不同粒子进行辐照，以实现多种离子束分析。

STIM 用于记录细胞的面密度图，其原理是基于能量粒子穿过不同密度细胞区域时的能量损失。微束质子激发X射线发射分析（micro-PIXE）和微束卢瑟福背散射分析（micro-RBS）可提供单个细胞水平上化学元素的空间分布与定量信息。采用能量为 1.5 兆电子伏的质子微束，将其聚焦至直径约 1 微米，并在由 STIM 识别出的目标细胞区域上进行扫描。

样品中从钠到钛的原子所发射的X射线可用于确定各元素的浓度。通过收集背散射质子，以测量用于归一化X射线强度所需的入射粒子总数。为校准X射线探测器响应，必须使用经认证的校准标样，以实现元素浓度的准确定量。

为了分析离子束数据，我们开发了一个用于 ImageJ 的新插件。首先，计算了 STIM 密度图。扫描透射离子显微图像中的对比度源于局部密度差异，能够用于检测细胞结构，例如细胞核和细胞质。

可同时处理多张图谱。每张图谱对应入射粒子在介质中传递的能量。数据分析的第二步是计算单个细胞的能谱。

粒子诱导X射线发射分析可提供样品的化学组成以及化学元素的元素分布图。元素分布图通过根据记录时光子对应的束流位置进行分类，并选择以特定元素为中心的能量窗口后计算得到。这些分布图通常表示在束流位置处检测到的事件数量，并包含定量数据。

针对每个选定元素，计算其对应的化学分布图，形成一组化学图谱。利用磷元素的PIXE数据确定每个细胞的感兴趣区域。随后，通过累加每个细胞感兴趣区域内各个像素点的独立谱图，得到对应整个细胞的综合谱图。

此后，可使用专用的PIXE和IBS分析软件提取每个细胞中化学成分含量的定量数据。此处展示了经多聚甲醛固定的细胞的荧光图像。第一行显示未暴露于二氧化钛纳米颗粒的细胞，第二行则为已暴露于二氧化钛纳米颗粒的细胞。

蓝色通道显示细胞核，绿色通道显示线粒体，红色通道显示钛。可以清楚地看到，对照组中不存在二氧化钛。从右侧的合并通道可以看出，纳米颗粒仅存在于细胞质中，而被排除在线粒体之外。

然而，该方法缺乏关于纳米颗粒浓度的定量信息。核微探针分析有望提供此类信息。这些图像均采用多种微探针分析技术获得。

同样，上方一排显示的是对照细胞，下方一排显示的是含有钛纳米颗粒的细胞。最左侧的图像显示了通过低温固定细胞测得的密度的STIM图像。接下来的三个图显示了通过PIXE测得的细胞内钾、磷和钛的含量。

同样，在对照组以及细胞核中均未观察到钛元素的存在。为了逐个细胞地定量分析钛的摄取情况，我们根据最右侧面板所示的细胞边界定义感兴趣区域，并测量这些区域内的元素丰度。基于这些PIXE测量结果，我们绘制了对照组和暴露组在单细胞水平上的元素丰度分布图。

对照组人群以白色表示，暴露组人群以黄色表示。此处存在的钛含量中位数与每平方厘米4微克的暴露剂量相比相当低。钛的吸收范围在人群中表现出较大差异，从每平方厘米0.2微克到每平方厘米1.8微克不等。

我们还注意到，暴露于纳米颗粒的样品中游离的细胞内离子（如钾和钙）有所增加，表明二氧化钛纳米颗粒的存在导致了细胞稳态的改变。核微探针分析可提供有关亚细胞水平的有用信息，并能对构成生物样品的化学元素进行定量分析。这些技术具有诸多优势。

其一，样品制备无需化学固定。其二，可研究更大区域，并能聚焦于其他感兴趣的区域。其三，可对化学元素进行定量分析，检测灵敏度可达每克几微克。

第四，识别细胞区室，例如细胞核、核仁和细胞质。在研究纳米颗粒在单个细胞内的内化过程时，准确确定这些细胞结构对于定量纳米颗粒毒理学至关重要。正如本文所研究的案例所示，观察和量化单个细胞内纳米颗粒的能力，使我们能够更深入地理解内源性和外源性化学元素（如金属氧化物纳米颗粒）在细胞内的累积情况。

本方案强调了核微探针分析在今后研究纳米颗粒与活细胞相互作用方面的适用性。该定量方法可提供有关这些纳米颗粒在检测、鉴定、定位和定量方面的影响力信息，并可在单细胞水平上应用于天然及化学修饰的纳米颗粒。