通过增强暗场显微镜与高光谱成像技术鉴定组织学样本中的金属氧化物纳米颗粒

本实验的总体目标是通过暗场显微镜结合高光谱成像技术，在组织学样本中识别金属氧化物纳米颗粒。首先，在含有纳米颗粒的阳性对照样本中确定感兴趣区域，并采集暗场图像；第二步是利用高光谱相机对感兴趣区域生成高光谱图像或数据立方体。

接下来，利用阳性对照数据立方体建立参考光谱库，并通过阴性对照进行过滤，以去除所有假阳性信号。最后一步是使用该参考光谱库对实验样本进行比对，从而识别并定位具有相同成分的纳米颗粒。最终，增强暗场显微镜结合高光谱成像技术可用于在组织学样本中识别金属氧化物纳米颗粒，相较于电子显微镜等其他方法，该技术更快速且资源消耗更低。

该方法相较于传统的纳米材料成像与表征技术（如电子显微镜）具有多项优势。其样品制备通常极为简便且为非破坏性；图像采集与分析所需的时间和成本更低，并可应用于多种基质中的纳米颗粒成像。

个体可能了解该方法，但有时会遇到困难，因为构建合适的阳性对照样本和参考光谱库既具有挑战性又耗时。然而，一旦完成这些初始步骤，实验样本便可得到快速评估。尽管该方法可为纳米颗粒的皮肤渗透提供见解，但也可应用于其他生物样本，如支气管肺泡灌洗液和血液涂片，以及非生物样本，例如职业暴露评估中使用的滤膜。

本技术的演示者为来自我实验室的医学生 Plar Sosa。首先，依次接通并开启光源、载物台控制器、光学相机、高光谱相机和计算机系统。然后将载物台和聚光镜升至工作位置，并在聚光镜镜头上小心滴加 3 至 5 滴 A 型浸油。若产生气泡，需将油擦除后重新滴加至镜头上。

接下来，将样品放置在载物台上，并缓慢升高聚光镜，直到浸油与载玻片底面接触。当浸油与载玻片接触时，可通过照明光圈迅速变亮的现象观察到接触情况。聚光镜就位后，切换至 10 倍物镜，聚焦并调整聚光镜以最大化亮度（如有需要），调节聚光镜对中旋钮，使亮斑居中。

打开光学成像软件。使用物镜微调焦旋钮对样本进行聚焦。然后找到感兴趣的区域。

根据需要调整聚光镜焦距以平衡照明。点击菜单栏中的设置选项卡，然后点击图像捕获按钮。进行捕获操作。

选择所需的图像格式并为图像指定文件名。此外，选择默认的时间间隔值，最后点击确定。接下来，进入曝光菜单，选择能够生成最高对比度图像的曝光设置。

此处，将亮度设为 0.0%。增益设为 2.8 分贝，快门速度设为 56 毫秒。通过单击菜单栏中的图像按钮来捕获图像。将物镜切换至 40 倍和 100 倍。

在更高倍率下采集图像时，确保将导光管导向高光谱相机，然后打开高光谱成像软件以采集高光谱数据立方体：在菜单栏中打开“开放高光谱显微镜”软件，选择“HSI 显微镜控制”。在此处设置物镜放大倍数和安全路径。接着，在设置中更改区域采集模式，并调整扫描行数。

本研究中，我们使用了720来设置曝光时间。此处我们采用0.25秒。其余参数均保持默认设置，然后点击预览HSI以查看图像。

观察生成的强度图，该图表示当用户在相机视场中心的x轴上移动时，最高波长处的强度变化。移动光标以生成该图的精确轮廓，此时左侧将出现一个数字强度指示器。

根据此预览图像，调节精细物镜焦距以使图像中的峰更加清晰。接下来，通过调节光源亮度和聚光镜焦距来优化光照强度，或取消预览并在软件中调整曝光时间。点击“捕获”，随后观察四个新窗口的出现及其名称。

波段列表。第一个为缩放波段。第一个为滚动波段，第一个为RGB波段。

最大化第一个 RGB 波段窗口，因为这是数据立方体，后续所有操作都将以此为参考。对吗？右键单击此数据立方体，将其另存为 TIFF 文件，然后单击“确定”。在数据立方体图像窗口中右键单击，然后左键单击 Z 轴剖面光谱。

当左侧弹出光谱轮廓窗口时，单击数据立方体目标上感兴趣区域的像素。最亮的像素即为可明确识别为所关注物质的像素。在粒子分析菜单下，选择粒子筛选工具以识别数据立方体中存在的粒子。

在新弹出的窗口设置中，光谱最大值必须超过指定数值，即高于背景像素，但低于目标材料。有效数据的最大值为 16,000。在颗粒过滤器审查工具窗口中，单击“全选”。

然后单击导出至光谱库，并为您的光谱库指定名称。选择一个样本作为阴性对照后，从该样本中获取多个数据立方体。使用高光谱相机至少采集一个数据立方体，但可采集更多。

为了提高选择性，在打开阴性对照数据立方体的情况下，单击分析菜单中的“筛选光谱库”选项，该菜单位于主程序工具栏上。点击“打开新文件”，选择之前为阳性对照创建的光谱库作为输入文件，然后单击“确定”。在“筛选CytoViva光谱库”窗口中，单击“图像”并为参考光谱库选择输出文件名，然后单击“确定”。

接下来，单击阴性对照数据立方文件名作为源图像。软件将分析光谱库，并移除与阴性对照数据立方中任何光谱相匹配的每条光谱。在实验数据立方打开的情况下，获取实验样品的数据立方。

在映射方法子菜单中点击光谱菜单，打开光谱角匹配器。在弹出窗口中选择实验数据立方体的名称，然后点击确定。如果没有列出文件名，请点击“打开新文件”并选择实验数据立方体。

然后在名为“端元收集，SAM”的弹出窗口中点击“确定”，在菜单栏中点击“导入”，然后选择“光谱库文件”。打开之前创建的参考光谱库，然后点击“确定”。

在名为“输入光谱库”的新弹出窗口中，单击“全选”，然后单击“确定”。接着右键单击“颜色”并选择“为所有项应用默认颜色”，先单击“全选”，再单击“应用”，然后选择输出文件名并单击“确定”。

打开数据立方体窗口中的叠加菜单，选择分类。然后导航至输出文件名称并点击确定。在交互式分类工具窗口菜单中，打开选项菜单，选择合并类别以创建统一的配色方案。

为了便于使用其他软件分析数据，首先从基础类别列表中选择一个单一谱图，然后选择除未分类以外的所有类别，将其合并到基础类别中，最后点击确定。

接下来，单击所选的基础颜色，所有匹配的光谱将显示为该颜色。要获得在黑色背景上显示匹配光谱的伪彩图像，请单击未分类颜色框，默认情况下该框为黑色。该技术最显著的优势在于能够通过暗场显微镜和高光谱成像来鉴定组织学样品中的金属氧化物纳米颗粒。这些图像利用皮肤组织样本展示了这一过程。

尽管某些颗粒在暗场光学图像中显而易见，但还需借助高光谱成像来检测其他颗粒。图中显示的是猪皮肤组织的表皮层，该组织曾暴露于Illumina纳米颗粒。在真皮层的角质层表面发现了一簇高对比度的纳米颗粒沉积，该区域曾暴露于二氧化硅纳米颗粒。

可见多种高对比度的纳米颗粒沉积在结缔组织上。最后，在皮下组织中，该组织暴露于叙利亚纳米颗粒。通过此方法可观察到大量高对比度的分散纳米颗粒沿脂肪细胞沉积，用于纳米颗粒的鉴定。

在其他组织样本中（如肺、肝、脾、肾和淋巴结）也是可行的。完成该操作后，可进行图像分析，以回答更多问题，例如颗粒计数和颗粒定位。需要权衡该方法与传统方法各自的注意事项和局限性，例如需要高度特异性的对照，以及光子成像分辨率的限制。

在选择最合适的分析技术以研究特定科学问题时，我们选择展示这一特定应用，因为它有望补充当前及未来的纳米毒理学研究，同时也有助于推动关于纳米颗粒在器官和组织中吸收、分布、代谢和排泄过程的研究。